摘要
大豆是食用植物油和蛋白质的重要来源，干旱是限制大豆生长和作物高产的主要非生物胁迫之一。GmProDH（脯氨酸脱氢酶）作为生物体脯氨酸代谢途径的关键限速酶参与脯氨酸的降解，从而影响植株对非生物胁迫耐受性。本研究对GmProDH基因家族进行生物信息学及逆境胁迫分析，从大豆中克隆得到GmProDH1基因，并构建CRISPR/Cas9植物表达载体，转化大豆毛状根，进行抗旱性鉴定、检测抗旱相关生理指标及基因，分析GmProDH1基因在大豆中的作用。同时采用农杆菌介导的方法，转化大豆品种东农50。主要研究如下: 1.GmProDH基因家族鉴定及表达分析 利用生物信息学手段对GmProDH基因家族进行分析，结果表明，在大豆基因组中鉴定出5个GmProDH基因，不均匀地分布在大豆4条染色体上，发生4对片段复制事件;系统进化树分析发现，GmProDH基因家族分为2个亚族，同一亚族间的基因结构和保守基序相似，存在不同的组织表达模式;顺式作用元件分析结果显示，GmProDH基因家族含响应逆境胁迫及植物激素的顺式作用元件。逆境胁迫下的表达模式分析结果显示，GmProDH基因家族成员均不同程度响应逆境胁迫。 2.大豆GmProDH1基因的克隆及CRISPR/Cas9载体构建 以大豆根部cDNA为模板，克隆GmProDH1基因，该基因CDS全长1497bp,编码498个氨基酸。构建了CRISPR/Cas9-GmProDH1植物表达载体，并将其转入发根农杆菌K599中。 3.CRISPR/Cas9-GmProDH1大豆毛状根的获得及其耐旱性分析 利用发根农杆菌介导法将CRISPR/Cas9-GmProDH1植物表达载体转入大豆毛状根，通过PCR鉴定、靶点测序及qRT-PCR,获得GmProDH1基因敲除大豆毛状根。 选取长势一致的毛状根进行干旱胁迫处理，观察表型并测定抗旱相关生理指标及抗旱相关基因表达。干旱胁迫下，基因敲除毛状根长势明显优于空载毛状根对照，其根长、根表面积、根鲜重、根干重均高于空载毛状根对照，基因敲除毛状根脯氨酸、可溶性蛋白、可溶性糖及抗氧化物酶活性均显著高于空载毛状根对照，但脯氨酸脱氢酶活性、丙二醛、过氧化氢及超氧阴离子含量均显著低于空载毛状根对照。基因敲除毛状根中6个抗旱相关基因（GmSABP2、GmXTH1、GmSAP5、GmP5CS、GmPLR、GmMYB14)均显著上调表达。结果表明，敲除GmProDH1基因可以增强突变体对干旱胁迫的抗性。 4.大豆敲除突变体的获得 利用农杆菌介导法将CRISPR/Cas9-GmProDH1载体转入大豆，通过PCR鉴定、靶点测序，获得大豆敲除突变体。 本研究初步验证GmProDH1基因抗旱功能并将CRISPR/Cas9-GmProDH1载体转入大豆品种东农50,为创制抗旱大豆新种质奠定基础。
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