摘要
背景：皮肤鳞状细胞癌（CutaneousSquamousCellCarcinoma,cSCC）是皮肤恶性肿瘤中的一种，在皮肤恶性肿瘤中占比较高。其发病率近年来呈上升趋势，且有逐步年轻化的趋势。该病虽手术治愈率高，但术后一旦发生转移，其死亡率高，尤其是头颈部的cSCC。截止目前，皮肤鳞状细胞癌的病因及发病机制仍不清楚，故人们需对皮肤鳞癌进行更深层次的研究。课题组通过对比鳞状细胞癌患者手术标本发现：皮肤鳞癌组织中，UCHL1基因的表达比癌旁组织低。所以，我们推测UCHL1基因可能在皮肤鳞癌中发挥抑癌作用。为验证该推测，本研究利用基因干扰技术和基因过表达技术，研究UCHL1基因在皮肤鳞状细胞癌发生发展中的作用。 目的：通过干扰UCHL1基因在人永生化表皮细胞Hacat细胞中的表达，以及通过过表达UCHL1基因在Colo16细胞中的表达，研究UCHL1基因对其生物学行为——增殖能力、迁徙能力、侵袭能力的影响，以此推测UCHL1基因在皮肤鳞癌发生发展中的作用。 方法： 1.构建人源UCHL1基因干扰慢病毒载体和人源UCHL1基因过表达慢病毒载体，将构建好的慢病毒载体进行包装和病毒滴度的测定。 2.使用UCHL1基因干扰慢病毒构建人永生化表皮细胞Hacat细胞稳转细胞株。并将细胞系各分为四组，空载慢病毒阴性对照组Hacat-LV-control与下调UCHL1基因实验组Hacat-LV-UCHL1-shRNA1、Hacat-LV-UCHL1-shRNA2、Hacat-LV-UCHL1-shRNA3。使用UCHL1基因过表达慢病毒构建人皮肤鳞状细胞癌细胞Colo16细胞稳转细胞株。并将细胞系各分为三组，空载慢病毒阴性对照组Colo16-LV-control与过表达UCHL1基因实验组Colo16-LV-H1、Colo16-LV-H2。 3.分组测序以鉴定Hacat细胞系中UCHL1基因干扰载体及Colo16细胞系中UCHL1过表达基因的阳性克隆。 4.通过WesternBlot技术检测Hacat细胞系及Colo16细胞系中UCHL1蛋白的表达水平。 5.通过CCK-8试剂盒检测Hacat细胞系及Colo16细胞系的细胞增殖能力强弱。 6.通过细胞划痕实验检测Hacat细胞系及Colo16细胞系的细胞迁移能力强弱。 7.通过Transwell细胞侵袭实验检测Hacat细胞系及Colo16细胞系的细胞侵袭能力。 结果： 1.UCHL1基因干扰慢病毒的滴度为：LV-UCHL1-shRNA1=1×108TU/ML，LV-UCHL1-shRNA2=5×108TU/ML，LV-UCHL1-shRNA3=1×108TU/ML。过表达慢病毒滴度为：LV-UCHL1-H1=5.06×108TU/ML，Colo16-LV-H2=5.06×108TU/ML。 2.测序鉴定Hacat细胞系中UCHL1基因干扰载体的阳性克隆，三组实验组UCHL1基因干扰载体成功构建。WesternBlot检测UCHL1蛋白表达，三组实验组较对照组显著减少（P＜0.05）。测序鉴定Colo16细胞系中UCHL1基因过表达载体的阳性克隆，实验组UCHL1基因过表达模型构建失败。 3.CCK8实验：三组实验组细胞的增殖能力比对照组细胞的增殖能力明显增强（P＜0.05）。划痕实验结果显示：三组实验组的细胞的迁移能力较对照组细胞的迁移能力能力明显增强（P＜0.05）。Transwell结果显示：三组实验组细胞的侵袭能力较对照组细胞的侵袭能力明显增强（P＜0.05）。 结论：干扰UCHL1基因的表达可以增加人永生化表皮细胞Hacat细胞的增殖、迁移和侵袭能力。我们推测，UCHL1基因在皮肤鳞状细胞癌中可能发挥抑癌基因作用。
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