摘要
背景：肾缺血再灌注(I/R)损伤是急性肾损伤(AKI)的重要原因之一，有着高死亡率。从近些年的研究来看，人脐带间充质干细胞以其特性在器官损伤修复和组织损伤修复中有很重要的作用。但是由间充质干细胞分泌的细胞外囊泡对于肾小管修复方面的潜在机制在一些程度上仍未知。 目的：研究人脐带间充质干细胞来源的细胞外囊泡(HucMSC-EVs)对肾脏缺血再灌注（I/R）损伤的影响及有关机制。 方法：通过化学法构建葡萄糖和氧缺乏(Oxygenandglucosedeprivation)再灌注的方式建立体外缺血再灌注（I/R）的细胞模型。收集人脐带间充质干细胞(HucMSC)的细胞上清液，然后采用梯度超速离心法对细胞外囊泡（HucMSC-EVs）进行分离和纯化。并用纳米粒子示踪分析、透射电子显微镜和Westernblot等方法对提取的细胞外囊泡进行鉴定。 用RT-qPCR来检测miR-148b-3p在HucMSC-EVs中的表达水平。用脂质体转染miR-148b-3p的mimics或inhibitor，在后续实验中构建miR-148b-3p过表达或敲低的HK-2，还通过使用流式细胞来检测凋亡、Westernblot等实验明确miR-148b-3p对肾脏I/R的保护作用。同时还应用生物信息预测软件预测miR-148b-3p靶基因的3’UTR区，另外荧光素酶报告证实了miR-148b-3p与靶基因的靶向关系。通过Westernblot的结果，探究了ERStress中信号通路中相关蛋白的表达水平与I/R损伤保护作用的关系。为了观察HucMSC-EVs在体内和体外实验中被摄取的情况，我们用激光共聚焦显微镜来对其观察和验证。为了证实HucMSC-EVs在体外实验中对肾脏I/R后的细胞是否有保护作用，我们分别用了流式细胞术检测细胞的凋亡、Westernblot等实验技术来对其进行探究。建立小鼠体内的肾脏I/R模型，采用HE染色和免疫组化等实验技术，探究HucMSC-EVs对肾I/R损伤的保护作用。 结果：HucMSC-EVs在体外和体内实验中对肾I/R损伤均起到保护作用，HucMSC-EVs中含较多的miR-148b-3p，通过过表达/敲低miR-148b-3p，我们证实HucMSC-EVs可以通过miR-148b-3p来抑制I/R诱导的HK-2细胞凋亡。预测miR-148b-3p靶基因是PDK4，随后通过双荧光素酶报告实验证实miR-148b-3p靶向结合抑制PDK4。另外也在体外实验中证实了源自EVs的miR-148b-3p能够抑制I/R引起的PDK4表达的升高，从而激活ERStress中的ATF-6信号通路，来抑制细胞凋亡。 结论：综上，该研究提供了证据表明HucMSC-EVs可以减轻I/R损伤作用是通过将miR-148b-3p转运至肾小管上皮细胞，下调PDK4的蛋白表达，从而增强内质网应激ATF-6通路来实现抑制作用。
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