摘要
背景：蛛网膜下腔出血（SAH，Subarachnoidhemorrhage）是一种神经外科常见的急性脑血管疾病，85%由动脉瘤破裂引起。绝大多数的SAH患者在影像学中缺乏明显的脑实质的损伤灶征象，但存在明显的血脑屏障（BBB,Bloodbrainbarrier）破坏和继发性神经功能障碍。近年来，对血脑屏障结构认识愈加深入，在慢性神经炎症疾病中发现血管内皮和基膜外有星形胶质细胞构成的胶质细胞屏障（GL,Glialimitans）形成，构成了微血管二级屏障。基于此，本研究旨在明确血脑屏障反应性星形胶质细胞是否作为第二道屏障在蛛网膜下腔出血后发挥保护作用，并探讨胶质细胞屏障的形成和调控机制。 第一部分星型胶质细胞屏障在蛛网膜下腔出血后形成的时空特点 目的：探究小鼠SAH后是否有胶质细胞屏障形成，及其形成的时空规律，并建立一套胶质细胞屏障体外研究模型。 方法：构建C57B6J小鼠血管内穿孔法SAH模型。通过透射电镜和免疫荧光组织染色观察Sham组小鼠和SAH后1、3天微血管周围是否有GL形成，及形成的时间规律。而后通过提取小鼠皮层原代星形胶质细胞和Transwell小室，建立起胶质细胞屏障体外研究模型，并通过跨膜电阻测量和免疫荧光细胞染色研究GL的形成特点。 结果： 1.SAH后1天即有星形胶质细胞足突之间的紧密连接在微血管周围形成一道致密的二级屏障，并随病程延长而减弱。 2.体外研究模型证实，星形胶质细胞可在氧合血红蛋白刺激下形成GL，并于24h达到跨膜电阻值的峰值，随处理时间延长而降低。 结论：小鼠SAH后1天即有GL在微血管外形成，并随病程延长而薄弱。体外实验同样验证了在体实验的结果。 第二部分周细胞对星形胶质细胞的调控作用 目的：明确脑微血管周细胞是否对星形胶质细胞及其形成的GL具有调节作用，并探讨周细胞对星形胶质细胞微环境和表型的影响。 方法：在体实验通过免疫荧光化学组织染色观察周细胞和星形胶质细胞的空间关系。体外实验建立了一套周细胞-星形胶质细胞接触式共培养模型，通过跨膜电阻测定，炎症因子微阵列和转录组芯片研究周细胞对星形胶质细胞的影响。 结果： 1.免疫荧光结果显示GL标志物CLDN1与周细胞和星形胶质细胞的共定位处具有良好毗邻关系。 2.共培养系统中，向周细胞区域施加氧合血红蛋白干预，可以使与其相接触的星形胶质细胞产生GL，并且形成的时间规律与在体实验一致。 3.明确了周细胞对星形胶质细胞微环境中炎症因子的表达谱，且受干预的周细胞调控星形胶质细胞向A1表型极化。 结论：脑微血管周细胞对星形胶质细胞GL的形成具有重要的调节功能，其调节方式与周细胞诱导星形胶质细胞向A1型极化有关。 第三部分周细胞调控星型胶质细胞屏障形成的分子机制 目的：研究周细胞通过何种分子机制与星形胶质细胞发挥交互作用，并探讨该机制下调控的GL在SAH后发挥了何种保护作用。 方法：通过qPCR选择并确定Eph/Ephrin家族中的哪对具体分子在周细胞-星形胶质细胞交互作用中发挥功能。在体实验中，使用能够过表达或敲低EphrinB2的慢病毒对小鼠脑组织进行基因层面调控，使用免疫荧光染色和伊文思蓝渗漏实验进行评价。离体实验中，使用敲低和过表达EphA4和EphrinB2的慢病毒对共培养系统的周细胞和星形胶质细胞进行转染，利用ELISA、蛋白免疫印迹实验和转录组芯片评价Eph/Ephrin信号的调控功能。最后，使用流式细胞术和神经功能评分研究GL在SAH后的保护作用。 结果： 1.氧合血红蛋白干预后，周细胞EphA4和星形胶质细胞EphrinB2表达显著增高。在体免疫荧光染色和蛋白免疫印迹实验也验证了SAH后周细胞和星形胶质细胞的EphA4/EphrinB2信号表达增强，并于GL形成具有相似的时空趋势。 2.抑制星形胶质细胞EphrinB2表达后，其GL形成也受到抑制。激活或过表达EphrinB2信号，GL形成增强。 3.抑制EphA4/EphrinB2信号可以降低周细胞和星形胶质细胞微环境的炎症因子分泌。 4.增强EphA4/EphrinB2信号使周细胞和星形胶质细胞微环境的炎症因子分泌增多，并促进星形胶质细胞向A1表型极化。 5.EphA4/EphrinB2信号调节下的GL形成减少SAH后炎细胞向脑实质浸润，主要以NK细胞为主。并显著改善SAH后小鼠神经功能。 结论：SAH后微血管周细胞的EphA4与星形胶质细胞的EphrinB2发生交互作用，通过将反应性星形胶质细胞向A1表型转化以调控GL的形成。GL作为有效的二级屏障，阻止了炎细胞向中枢神经系统实质浸润，改善了神经功能。为血脑屏障保护和治疗提供了新的靶点。
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