摘要
目的：由于神经纤维束再生能力差和复杂的微环境，脊髓损伤（Spinalcordinjury，SCI）已成为当今医学界的一大难题。本研究旨在利用脊髓中神经元定向排列成神经传导束的解剖特征，拟构建多成分定向神经导管，实现神经元在神经纤维导管的定向生长，从而有助于脊髓损伤的治疗，本研究不仅为3D静电纺丝的研究提供新的思路，而且也为临床脊髓损伤的治疗提供新思路和新方法。 方法：（1）筛选3D电纺材料及工艺：通过对一系列聚乙烯醇（PVA）的纺丝性、冻融性能进行筛选，确定3D打印静电纺丝的材料及比例，并筛选3D电纺最优工艺参数，制备了定向排列的PVA纤维。（2）考察定向纤维生物相容性及细胞定向生长：从大鼠鼻粘膜分离外胚层间充质干细胞（EMSCs），并考察PVA电纺纤维的生物相容性及对细胞生长方向的影响。采用形态学观察与免疫荧光技术（IF）筛选诱导EMSCs向神经细胞分化的处方，并考察PVA电纺纤维间距对诱导细胞生长的影响。（3）研究负载异甘草素的红细胞膜纳米粒子抗炎效果：通过低渗法提取红细胞膜（RBCM），制备负载异甘草素的红细胞膜纳米粒子（ISL@RBCNPs），并对其进行FT-IR、SEM、TEM和DLS粒子分析和表征。通过检测蛋白表达和活性氧（ROS）的变化，考察ISL@RBCNPs对LPS极化的巨噬细胞的抗炎效果（。4）构建神经导管：采用3D挤出打印制备负载ISL@RBCNPs的甲基丙烯酸化明胶（GelMA）作为底膜。在底膜上采用3D静电纺丝技术打印定向结构，并接种细胞，通过卷曲形成导管状结构。考察细胞的活性及ISL@RBCNPs在导管中的释药情况。（5）大鼠脊髓损伤修复：将神经导管植入SD大鼠脊髓损伤模型并考察修复效果。根据BBB评分、斜板实验和足迹分析对脊髓损伤修复进行初步评估。检测脊髓外观及H＆E染色以评估组织病理学差异。通过尼式及髓鞘染色检测损伤处神经元及髓鞘恢复情况，采用免疫荧光染色检测神经相关蛋白（NF200、TuJ1、synGAP、GFAP）的表达情况等。 结果：（1）确定3D电纺材料及工艺：通过材料筛选及打印条件筛选，确定3D电纺最优纺丝材料及比例为5%PVA4688+5%PVA117、确定了静电纺丝的最优工艺参数：针头型号22G、电场电压4kV、挤出速度0.05μL/s、打印速度20mm/s、针头高度0.5mm。SEM观察结果显示，PVA纤维丝直径约1μm，且多根纤维呈定向排列，间隔均匀。（2）定向PVA电纺纤维具有良好的生物相容性并成功诱导EMSCs定向生长及神经元分化：成功从新生SD大鼠鼻中隔黏膜提取到EMSCs，并通过免疫荧光及流式鉴定其阳性表达间充质干细胞标志物。MTT实验显示，PVA纺丝无明显细胞毒性。细胞骨架染色表明，定向排列的PVA纤维可有效实现3T6及EMSCs细胞的定向排列。EdU实验和活/死细胞染色结果表明，PVA对细胞增殖及死活无影响。成功筛选出诱导EMSCs向神经细胞分化并表达神经元标志物的处方，且诱导神经元沿PVA定向生长，纺丝间隔20μm。（3）成功制备具有抗炎效果的ISL@RBCNPs：成功提取RBCM并负载ISL后，RBCNPs平均粒径从225.16±12.68nm增加到264.59±44.08nm。TEM图像显示ISL@RBCNPs具有明显涂层结构，ζ电位及FT-IR也都表明ISL@RBCNPs的成功形成。ISL@RBCNPs的包封率为55.63%，载药量为38.9±2.99%。ISL@RBCNPs能促进LPS极化的RAW264.7细胞CD206及Arg-1的表达，降低iNOS的表达，抑制活性氧的产生，从而有效抑制炎症并保护受损神经元。（4）成功构建含有多成分释药系统的定向神经导管：采用3D挤出打印技术制备了含有ISL@RBCNPs的GelMA底膜，利用3D静电纺丝技术在底膜纺出定向排列的PVA纤维。体外释放结果表明，ISL可在在底膜中缓慢释放。细胞相关实验结果表明，底膜组EMSCs细胞存活率为88.25%±7.42，3T6细胞存活率为96.46%±2.86，且EMSCs细胞可在底膜定向生长及分化。（5）大鼠脊髓损伤修复结果：SCI结果表明，诱导定向神经导管8周BBB评分可恢复至15分左右，斜板实验角度恢复约36°左右，显著高于模型组（Plt;0.01）。结合脊髓外观和H＆E结果，神经导管组整体修复良好。尼氏及髓鞘染色显示，相比于模型组，定向神经导管组尼氏体排列有序，并无明显的脱髓鞘和空洞。定向神经导管组在损伤区域可以看到大量紫色神经元与浅蓝色髓鞘，表明神经导管可联通上下神经纤维，促进髓鞘再生，提高损伤处神经元的存活。免疫荧光结果显示，诱导定向神经导管组上调脊髓损伤部位NF200、TuJ1和synGAP蛋白表达，下调GFAP表达。这些结果证明了多成分定向神经导管对脊髓修复具有关键作用，包括抑制炎症和瘢痕增生，促进新神经元的生长和神经修复。 结论：通过采用3D定向静电纺丝技术制备定向排列PVA纤维，成功诱导大鼠外胚层间充质干细胞EMSCs定向生长与神经元分化。同时，结合红细胞膜负载的异甘草素纳米粒子构建含有多成分释药系统的定向神经导管，成功修复大鼠脊髓损伤。这为新型释药系统构建、脊髓损伤修复、3D打印技术的创新和应用提供了新思路、新技术。
NETL