摘要
【目的】 黑色素瘤是一种具有高度侵袭性和转移性的恶性肿瘤，其诊断的及时性对于治疗方式的选择和疾病的愈后具有重要意义。通过将微纳光纤探针和拉曼光谱结合，获得黑色素瘤细胞的拉曼光谱，并结合转录组测序对其耐药性进行初步分析。同时，还利用表面增强拉曼光谱(Surface-enhancedRamanscattering,SERS)和卷积神经网络(Convolutionalneuralnetworks,CNN)，探索黑色素细胞和不同类型黑色素瘤细胞的分类识别，以上体系的构建为黑色素瘤的诊断及鉴别和耐药性研究提供了新的思路。 【方法】 1.通过火焰加热、熔融拉锥的方法制备出具有锥角的光纤探针，并将制备好的探针用于捕获细胞、细菌、微球，评估该探针所具备的捕获能力，后将探针用于在拉曼显微镜下操控单个细胞时，保证能够获得细胞的拉曼光谱，并结合传统的统计学分析方法实现不同黑色素瘤细胞的分类。 2.选择表面带正电荷的金纳米粒子固态基底(Positivelychargedgoldnanoparticlesolid-statesubstrates,AuNPs+-PS)，收集1种黑色素细胞和5种黑色素瘤细胞以及其中两类耐药细胞的拉曼光谱，并对不同细胞在拉曼光谱上表现出的差异进行分析。利用测量的大量光谱数据，构建了多个CNN分类模型，比较数据预处理前后的分类结果，该模型在仅对数据进行预处理的前提下也能够对细胞进行分类识别，与传统的分类识别方法相比具有较高的准确率；模型的稳定性均采取十倍交叉验证来判断，以获得最优的分类效率。 3.利用制备好的光纤探针在拉曼显微镜下获得细胞的拉曼光谱后，研究黑色素瘤细胞的耐药性，对A375亲本细胞和A375R2.0细胞加药物维罗非尼(Vemurafenib，Vem)作用48小时，测量A375亲本细胞和A375R2.0细胞加药前后的拉曼光谱图。同时，对以上细胞进行转录组基因测序，结合光学显微镜下细胞的生长情况及其拉曼光谱测量和RNA测序结果，实现单细胞的多模态分析并且从不同角度反映了药物对细胞的作用。 【结果】 1.通过火焰加热、熔融拉锥的方法制备出了锥形光纤探针，当将该探针置于微粒溶液或者细菌溶液中并通入980nm的近红外光时，能够实现其有效分离。此外，实验也证明，这种分离方法也同样适用于分离尺寸较大的细胞，即能够捕获到单个细胞。 2.除了在普通光学显微镜下能观察到细胞被捕获分离外，光纤探针在拉曼显微镜下同样能实现细胞的捕获分离，同时，还能获得被捕获的不同细胞的拉曼光谱。 3.使用主成分分析-支持向量机(PrincipalComponentAnalysisandSupportVectorMachines,PCA-SVM)对获得的光谱进行分类，A375,MEWO和MV3的分类准确率为92%，A375R0.5和A375R2.0的分类准确率为97.5%。 4.通过SERS获得了黑色素细胞和不同黑色素瘤细胞的拉曼光谱，黑色素细胞和黑色素瘤细胞的拉曼特征峰存在差异，CNN网络对其进行识别的准确率大于98%。 5.CNN网络对不同突变类型的黑色素瘤细胞的分类准确率大于98%，对野生型细胞MV3和MEWO的分类准确率为100%，3株突变型细胞间的识别准确率也在98%以上。同种细胞诱导出来的不同耐药程度的细胞光谱也具有差异性，为了对细胞进行分类和识别，A375诱导的耐药细胞识别准确率达98%以上，M14诱导的耐药细胞分类准确率较低，仅在91%以上。 6.CNN网络用于多级细胞间的分类时，平均准确率为95.57%，并且只需要对数据进行简单的预处理，与使用传统的分类方法(PrincipalcomponentanalysiscombinedwiththeK-nearestneighbor,PCA-KNN)获得的58.57%的准确率相比，有了较大的提升。 7.利用光纤探针在拉曼显微镜下捕获并测量A375亲本细胞，与Vem作用48小时的A375亲本细胞和A375R2.0细胞的光谱，拉曼光谱的改变主要体现在745cm-1，1001cm-1，1090cm-1，1304cm-1，1450cm-1，1655cm-1。对以上三种细胞进行光学显微镜下观察、转录组基因测序以及拉曼光谱差异分析，转录组测序差异基因的表达与拉曼峰变化一致，三者共同为A375细胞耐药性研究提供了相互印证的依据。 【结论】 制备了具有捕获能力的锥形光纤探针，该光纤探针除了能够分离细菌和微球外，还能够在拉曼显微镜下捕获黑色素瘤细胞，并获得其拉曼光谱，联合PCA-SVM能够实现不同黑色素瘤细胞的高准确率分类。利用表面带正电荷的金纳米粒子固态SERS基底测量了黑色素细胞和不同黑色素瘤细胞的拉曼光谱，结合CNN分类模型，省去了繁琐的数据处理步骤，实现了细胞之间的高准确率分类。黑色素瘤细胞A375的耐药性研究通过普通光学显微镜下观察生长状态、测量拉曼光谱和RNA转录组基因测序共同反映。以上实验为黑色素瘤的分类和诊断及其耐药性的研究提供了新的研究角度，也为黑色素瘤的诊断后的治疗提供了参考。
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