摘要
研究背景： 甲状腺癌是人类内分泌系统中最常见的恶性肿瘤，其主要病理类型包括甲状腺乳头状癌、滤泡状癌、髓样癌以及未分化癌。大多数甲状腺滤泡状癌预后较好，但是少数甲状腺滤泡状癌具有高度侵袭性的特点，其肿瘤生长较快并且具有血管侵犯倾向，可血行转移至肝、肺和骨等组织，因此病人预后较差且复发风险较高。探索甲状腺滤泡状癌的分子机制及治疗策略成为亟待解决的问题。 血红素加氧酶-1（HO-1）在肿瘤的发生发展中发挥着重要的作用，可以调控氧化应激。多种人类恶性肿瘤与HO-1的升高有关，HO-1有助于形成肿瘤微环境，支持癌细胞的生长、血管生成和转移，但癌细胞中HO-1过表达可导致其发生铁死亡。铁死亡作为一种新发现的程序性细胞死亡方式，其标志性特征是铁依赖性的脂质过氧化物的积累。铁死亡在癌症治疗中具有巨大的应用潜力。姜黄素在药理学上可以抑制癌细胞的生长，并通过上调HO-1的表达促进细胞内铁的积累及活性氧的产生进而诱导铁死亡的发生。然而，姜黄素对甲状腺滤泡状癌的作用机制尚不清楚。 目的： 第一部分：从组织和细胞水平上探讨HO-1的表达情况，并进一步研究HO-1与铁死亡的关系。 第二部分：探讨姜黄素对甲状腺滤泡状癌的影响并研究其诱导甲状腺滤泡状癌死亡的主要方式。 第三部分：探究姜黄素通过上调HO-1的表达诱导甲状腺滤泡状癌发生铁死亡。 方法： 第一部分：第二代高通量测序技术用于检测甲状腺滤泡状癌组织及癌旁组织中差异表达的mRNA水平。选取50对甲状腺滤泡状癌组织和癌旁组织的石蜡标本进行免疫组化染色，分析HO-1的表达情况。蛋白质免疫印迹（westernblot）测定HO-1蛋白在甲状腺滤泡状癌组织和癌旁组织中的表达。在细胞层面上，westernblot检测HO-1蛋白在FTC细胞系（FTC-133和FTC-238）和甲状腺正常细胞系（Nthy-ori-3-1）的表达。Erastin（铁死亡诱导剂）用于分析HO-1的表达高低与铁死亡的关系。 第二部分：通过CCK-8法筛选出姜黄素作用于FTC-133和FTC-238细胞的药物浓度。接下来，克隆形成实验、细胞迁移和侵袭实验用于分析姜黄素作用于FTC细胞后对其增殖，迁移和侵袭的影响。最后，铁死亡抑制剂（Fer-1）、铁螯合剂（DFO）、自噬抑制剂（CQ和3MA）和凋亡抑制剂（Z-VAD-FMK）用于推测姜黄素诱导FTC细胞死亡的主要方式。 第三部分：运用westernblot检测HO-1和GPX4蛋白的表达。利用铁离子检测，GSH检测，MDA检测和脂质过氧化物（LipidROS）检测分析姜黄素诱导FTC细胞发生铁死亡的指标。接下来，通过敲低或过表达HO-1进一步探索姜黄素诱导FTC细胞发生铁死亡的调控机制。通过免疫共沉淀（Co-IP）实验分析HO-1和GPX4是否存在蛋白互作。在低表达HO-1的FTC细胞系中敲低GPX4，通过检测LipidROS水平，观察能否提高姜黄素诱导FTC细胞发生铁死亡的敏感性。最后，我们进行了裸鼠皮下成瘤的体内实验，观察姜黄素和HO-1表达的高低对肿瘤生长的影响。 结果 第一部分 （1）测序数据表明HO-1在甲状腺滤泡状癌组织中的表达值为16.1653，癌旁组织中的表达值为4.98972，改变倍数为1.69587,p值=0.00005,q值=0.00548452。提示甲状腺滤泡状癌组织中HO-1的表达值高于癌旁组织。 （2）通过免疫组化染色分析发现HO-1在甲状腺滤泡状癌组织和癌旁组织中的阳性表达率分别为60%和36%，差异有统计学意义（χ2=5.77p=0.016）。 （3）Westernblot检测发现HO-1蛋白在甲状腺滤泡状癌组织中明显高于癌旁组织。同样地，FTC-133和FTC-238细胞中HO-1蛋白表达明显高于Nthy-ori-3-1细胞。 （4）高表达的HO-1在铁死亡诱导剂的作用下促进甲状腺细胞发生铁死亡。反之，低表达的HO-1抑制其发生铁死亡。 第二部分 （1）姜黄素明显降低了甲状腺细胞的活力，且呈剂量依赖性。20%的生长抑制浓度（IC20）在FTC-133和FTC-238细胞中分别为9.35μM和10.56μM，50%的生长抑制浓度（IC50）分别为23.29μM和22.62μM。然而，在Nthy-ori-3-1细胞中IC20和IC50的值分别为32.25μM和92.36μM。 （2）克隆形成实验、细胞迁移和侵袭实验表明姜黄素以剂量依赖的方式明显抑制FTC细胞的增殖、迁移和侵袭。 （3）在姜黄素浓度为10μM时，多种药物抑制剂可以明显提高FTC细胞的活力。当姜黄素浓度为20μM时，只有Fer-1可以同时提高FTC-133和FTC-238细胞的活力。 第三部分 （1）姜黄素呈剂量依赖性的降低GPX4蛋白的表达；升高HO-1蛋白的表达；增加细胞内铁离子的浓度和MDA水平；降低GSH水平；并且诱导FTC细胞发生脂质过氧化。 （2）敲低HO-1的FTC细胞通过上调GPX4蛋白的表达，抑制姜黄素诱导的铁死亡。反之，过表达HO-1的FTC细胞通过下调GPX4蛋白的表达，促进姜黄素诱导的铁死亡。 （3）免疫共沉淀实验表明HO-1可特异性与GPX4相互作用并调控其表达。低表达HO-1的FTC细胞抑制了姜黄素诱导的铁死亡。然而，当敲低GPX4后逆转了此现象，导致细胞脂质过氧化水平升高。 （4）裸鼠肿瘤在姜黄素的作用下生长较慢，肿瘤重量较轻，体积增加缓慢，促进了铁死亡的发生。过表达HO-1的裸鼠肿瘤在姜黄素的作用呈现出相同的情况。 结论 HO-1在甲状腺滤泡状癌中的表达高于癌旁组织。HO-1在FTC细胞中过表达可发生铁死亡。姜黄素通过上调HO-1的表达抑制甲状腺滤泡状癌的发生和转移，这可能与姜黄素诱导铁死亡信号通路的激活有关。尽管还需要进一步研究来确定姜黄素作用于甲状腺滤泡状癌的具体机制，但对于无法耐受手术或难以诊断的甲状腺滤泡状癌患者来说，可能会提供一种缓解甲状腺滤泡状癌的治疗途径。
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