摘要
碱性蛋白酶是一类在中性至碱性pH范围内具有催化活性的蛋白水解酶，在食品、医药、洗涤剂和皮革制造等行业中具有广泛应用。微生物是碱性蛋白酶的主要来源。本研究旨在从自然环境中筛选高产碱性蛋白酶的菌株，并对其所产碱性蛋白酶的性质进行研究。主要研究内容包括，从不同环境中筛选获得一株可产碱性蛋白酶的菌株，并进行鉴定；接着以该菌株为研究对象，利用单因素实验对其产碱性蛋白酶的发酵条件进行优化；然后通过硫酸铵沉淀、葡聚糖凝胶层析、离子交换层析技术对该酶进行纯化，并考察了有机溶剂、温度、氧化剂、pH、表面活性剂、金属离子等对纯化的碱性蛋白酶酶活性的影响；最后克隆得到了相应的编码基因，并利用分子对接和动力学模拟方法，针对影响酶催化活性的主要因素进行了计算分析，获得了酶整体结构特别是催化活性位点附近区域的构象变化，解析影响酶活的具体机制。主要的研究结果如下： （1）产碱性蛋白酶菌株的筛选及鉴定。利用脱脂奶粉平板透明圈初筛和酶活测定复筛，从堆肥土样中筛选到一株产碱性蛋白酶的菌株L1，利用平板划线对其分离纯化，经形态学、生理生化分析及16SrDNA测序鉴定为萎缩芽胞杆菌（Bacillusatrophaeus），将其名为BacillusatrophaeusL1。 （2）菌株L1产碱性蛋白酶发酵条件的优化。采用单因素实验对B.atrophaeusL1产碱性蛋白酶的培养条件进行了优化，最佳发酵产酶培养基为：木糖2.0%，蛋白胨2.0%，Na2HPO4.12H2O1.5%，KH2PO40.3%，MgSO4.7H2O0.05%，CaCl20.1%；最适发酵条件为：培养温度37℃，转速180r/min，250mL挡板摇瓶装液量50mL，接种量4%，初始发酵pH为6.0，发酵时间30h。优化后菌株L1产碱性蛋白酶的酶活力可以达到8941.46U/mL，相比最初酶活提高了12.36倍。 （3）碱性蛋白酶的分离纯化。采用硫酸铵分级沉淀对菌株L1所产的碱性蛋白酶进行初步分离纯化，得到的粗酶经过缓冲液透析除盐后，依次通过SephadexG-75层析柱和阳离子交换层析进行纯化，获得了电泳纯的蛋白酶，其回收率为1.85%，纯化倍数为25.44，经SDS-PAGE检测发现纯化的碱性蛋白酶的相对分子质量约为28kDa，将纯化后的碱性蛋白酶命名为APL1。 （4）碱性蛋白酶酶学性质研究。结果发现，APL1在60℃和pH9.0时催化能力最好，该酶在30~40℃、pH7.0~10.0范围内稳定；添加10mmol/L的Mn2+可以将酶活性提高到137%，而Cu2+、Fe3+和Al3+则对APL1的活性有显著的抑制作用；各种抑制剂中，苯甲基磺酰氟（PMSF）对酶活性的抑制效果最为明显，推测该酶的活性中心存在丝氨酸残基；APL1在10%的各种有机溶剂中能保持较好的活性，当有机溶剂浓度为30%时，其在乙二醇、丙三醇、二甲基亚砜（DMSO）中仍能保持85%以上的相对酶活性；该酶对非离子型表面活性剂表现出较好的耐受性，当曲拉通X-100（TritonX-100）浓度为10%时，APL1的活性提高到144%；APL1在1%和5%的H2O2处理1h后分别保留56.84%和26.63%的酶活。底物特异性实验表明，APL1对酪蛋白的水解效率最高（定为100%），对脱脂牛奶和卵清蛋白的水解能力分别为38%和21%；以酪蛋白为底物测定了该酶的底物动力常数，得出Km值和Vmax值分别为13.9mg·mL-1和181.8mg·mL-1·min-1。 （5）APL1编码基因的克隆及酶活影响的机制解析。结合蛋白质测序结果，在NCBI数据库中Blast到萎缩芽孢杆菌属碱性蛋白酶的同源基因，设计引物，通过PCR的方法从B.atrophaeusL1中克隆得到APL1的编码基因，序列全长1092bp，编码363个氨基酸；然后利用分子动力学模拟对影响酶催化活性的主要因素进行了计算分析，通过分子对接获取不同因素添加前后APL1整体及酶催化活性中心的结构变化，系统研究不同因素与酶催化活性之间的“构效关系”，研究发现H2O2、表面活性剂、有机溶剂通过氢键或者疏水相互作用覆盖或者结合在酶活性中心的关键氨基酸上而影响其活性，而金属离子根据极性的大小对酶的结构产生不同程度的影响从而直接导致酶催化活性的变化。 综上，本研究通过筛选得到了一株高产碱性蛋白酶的菌株B.atrophaeusL1，通过研究其产酶条件，明确了最佳发酵条件；酶学性质研究发现纯化后的碱性蛋白酶在30~40℃、pH7.0~10.0具有良好的稳定性，并对氧化剂、有机溶剂及表面活性剂表现出一定的耐受性，且Mn2+对其酶活性具有明显促进作用，以上结果表明其在洗涤剂等方面有了一定的应用潜力，通过分子对接和动力学模拟进一步解析了不同因素对酶学性质的影响机制，为后期研究该酶的结构、功能和应用提供了一定的依据。
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