摘要
花色是花卉品种创新的主要目标性状之一，花色素途径在上世纪九十年代已经被解析，但花色形成过程中受外界环境调控及表观遗传规律是近年来园艺学领域的研究热点。花色是由多种化学色素决定的，是观赏植物的重要特征，花青素是其中的主要成分。在露地菊栽培过程中，发现了一株同时含有黄色和粉色花的花色嵌合露地菊‘金粉双蝶’，其通过无性繁殖产生花色单一露地菊新品系‘金双蝶’和‘粉双蝶’。本研究以露地菊‘金双蝶’和‘粉双蝶’作为研究对象，通过代谢组学、转录组学、瞬时转染技术分析，筛选获得调控花青素成途径的关键差异基因CmMYB6。通过McrBC-PCR技术及BisulifiteSequencing分析，确定CmMYB6基因启动子区CHH类型DNA甲基化的分子机制。借助CRISPR-dCas9-TET1cd表观基因工程手段，实现CmMYB6启动子区的定向DNA去甲基化，恢复花青素的生物合成，为调控花青素生物合成的表观遗传机制的研究奠定基础。主要研究结果如下: 一、花青素合成途径关键差异基因CmMYB6的获得及功能验证 1.以露地菊‘金双蝶’与‘粉双蝶’作为研究材料，测定其花瓣中类胡萝卜素、黄酮醇类化合物、花青素的含量结合代谢组学分析，确定‘金双蝶’与‘粉双蝶’花瓣中花青素的累积具有较大差异。进一步的转录组学分析及基因表达量检测，结果显示花青素合成途径转录因子CmMYB6和受到CmMYB6调控的下游结构基因CmF3H、CmDFR、CmANS、Cm3GT在‘粉双蝶’中的表达量较‘金双蝶’显著升高。使用瞬时转染技术对CmMYB6的功能进行分析后，确定了CmMYB6参与花青素合成途径并行使促进花青素合成的生物学功能。 2.针对以上两个品系的基因组重测序及CAPs-PCR分析结果表明，‘金双蝶’与‘粉双蝶’具有相同的基因组序列，排除了基因突变导致体细胞变异的可能。 二、CmMYB6启动子区表观遗传修饰的解析 1.利用McrBC-PCR技术确定CmMYB6启动子区的DNA甲基化修饰程度，结果表明CmMYB6启动子区DNA甲基化水平在以上两个露地菊品系中存在差异，且在‘金双蝶’花瓣中DNA甲基化水平更高。进一步通过BisulifiteSequencing分析获得‘金双蝶’花瓣中的高DNA甲基化是由于CHH类型甲基化水平的升高导致的。SmallRNA测序分析表明，参与RdDM途径调控CHH类型甲基化的24-ntsiRNA在高甲基化‘金双蝶’CmMYB6启动子区富集程度显著高于‘粉双蝶’。 2.通过对‘金双蝶’与‘粉双蝶’连续三代无性系表型观察、色素含量分析、基因表达量分析、DNA甲基化修饰程度分析结果表明，在露地菊‘金双蝶’中CmMYB6启动子区的DNA甲基化程度高，基因表达量低导致花青素合成受到抑制，而‘粉双蝶’则表现出相反的表型。并且CmMYB6启动子区的DNA甲基化修饰状态能够在无性繁殖过程中通过有丝分裂过程中产生的胞间连丝稳定的遗传到下一代。 三、CmMYB6启动子区表观遗传修饰介导花色改良的技术探究 1.通过对12个不同花色的露地菊品系的代谢组学分析、色素含量测定、基因表达量检测、DNA甲基化程度检测分析，表明CmMYB6启动子区DNA甲基化修饰程度与花青素的生物学合成及花青素合成途径相关基因的表达量具有相关性。随着CmMYB6启动子区DNA甲基化程度的逐渐升高，花青素合成途径相关基因的表达量逐渐降低，花青素累积下降，呈现负相关性。 2.构建定向去除CmMYB6启动子区DNA甲基化的CRISPR-dCas9-TET1cd去甲基化酶载体，利用瞬时转化原生质体技术及蘸花法瞬时转染技术的进一步分析表明，CRISPR-dCas9-TET1cd系统能够定向的去除露地菊‘金双蝶’中CmMYB6启动子区DNA甲基化状态，CmMYB6基因表达量升高，花青素的生物合成得到恢复。 以上结果表明，CmMYB6基因作为露地菊花青素合成途径的正调控因子，其启动子区通过CHH类型DNA甲基化水平的提高能够抑制花青素的生物合成，而CRISPR-dCas9-TET1cd能够定向去除该基因启动子区的甲基化状态，进而恢复花青素累积。本研究揭示了露地菊花青素合成途径CmMYB6基因受到表观遗传修饰的分子机制，为表观遗传学参与观赏植物的花色定向改良及新品种培育奠定基础。
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