摘要
背景： 非酒精性脂肪性肝病（NonalcoholicFattyLiverDisease，NAFLD）是以肝脏甘油三酯（Triglyceride，TG）积累为特征的肝慢性疾病，近年来发病率逐步上升。女性在绝经后体内雌激素水平下降，NAFLD的发病率显著高于绝经前。氧化应激反应是体内活性氧产生超过抗氧化解毒能力时产生的一种病理状态，是NAFLD发病过程的重要环节之一。NAFLD患者体内游离脂肪酸增加，导致肝脏中脂质氧化和三羧酸循环增加，产生过多的活性氧（ReactiveOxygenSpecies，ROS），同时抗氧化系统被受损，抗氧化剂的活性降低，ROS不能得到有效的清除，导致多种生物分子的氧化损伤、细胞结构破坏，进而引起细胞凋亡和炎症反应。核因子E2相关因子2（NuclearFactorErythroid-2-RelatedFactor2，Nrf2）是机体减轻氧化应激反应的主要调节因子，在受到刺激后，从细胞质转移到细胞核中，与抗氧化元件结合并促进下游抗氧化基因的表达，可作为防治NAFLD的潜在治疗靶点。 骨质疏松症（Osteoporosis，OP）是由于骨代谢不平衡导致骨量和骨微观结构恶化的骨病，其特征是骨质脆弱和骨折风险增加。绝经后OP的发病率也显著高于绝经前，雌激素水平下降会导致骨代谢紊乱。绝经后NAFLD和OP的发病存在一定相关性，衰老、久坐不动的生活方式均是NAFLD和OP共同的危险因素，患NAFLD绝经后女性的平均骨密度（Bonemineraldensity，BMD）比正常绝经后女性低。NAFLD的发生发展可促使骨髓腔内脂肪细胞增加、成骨细胞生成减少。炎症反应升高和IGF-1水平降低，均可诱导OP的发生。绝经后NAFLD患者体内炎症因子水平升高，呈现慢性炎症状态，且IGF1水平下降，进而增加OP的发病风险。 外源性补充雌激素可改善绝经NAFLD和OP症状，但长期使用存在一定健康风险。雌马酚（Equol，Eq）是一种天然植物化合物，由大豆异黄酮（SoyIsoflavone，SIF）在肠道内代谢产生，其结构与雌激素十分相似，类雌激素作用明确，具有较强的抗炎、抗氧化、抗肿瘤、改善糖脂代谢等生物学活性。研究发现外源性补充SIF可对绝经后NAFLD和OP产生有益的效应，Eq与其它异黄酮类化合物相比，具有结构更稳定、易于吸收、清除率低等优点，但Eq对绝经后NAFLD合并OP的作用尚不清楚。本研究针对Eq对绝经后NAFLD中肝脏氧化应激和骨代谢的作用及机制进行了研究。 目的 本研究旨在探讨Eq对绝经后NAFLD大鼠肝脏和骨的保护作用，探讨Eq调控肝脏氧化应激反应和骨代谢的可能机制，为临床预防和治疗绝经后NAFLD提供新的思路和实验依据。 方法 1.采用卵巢切除（Ovariectomy，OVX）和高脂饮食（highfatdiet，HFD）建立绝经后NAFLD动物模型，并使用不同剂量Eq和雌二醇（Estradiol，E2）灌胃干预。动物共分6组，每组n=8，分别为对照组（Con，假手术）、模型组（Mod）、Eq低剂量组（Eq-L，20mg·kg-1·d-1）、Eq中剂量组（Eq-M，40mg·kg-1·d-1）、Eq高剂量组（Eq-H，80mg·kg-1·d-1）和E2干预组（E2，0.25mg·kg-1·d-1），干预16周。首先通过检测大鼠血脂变化、肝脏脂质累积和氧化应激水平，观察Eq对绝经后NAFLD肝组织脂质代谢和氧化应激水平的影响；进而通过Westernblot、RT-PCR方法，检测Eq对Nrf2信号通路的影响，探讨Eq调控氧化应激的潜在机制。 2.油酸钠诱导HepG2细胞建立体外氧化应激细胞损伤模型，并使用不同浓度Eq、E2干预，观察比较Eq对细胞脂质累积和氧化应激反应的影响，使用Westernblot、RT-PCR等方法，检测Eq对Nrf2信号及其下游抗氧化基因的影响。 3.为进一步阐明Eq调控氧化应激的分子机制，首先通过siRNA沉默Nrf2基因，验证Nrf2在Eq调控氧化应激中的作用；进而通过使用PI3K特异性抑制剂，验证PI3K及其下游AKT、GSK3β通路在Eq对Nrf2信号调控中的作用；为验证Eq的类雌激素效应，通过计算机模拟Eq和G蛋白偶联的雌激素受体（GPER）蛋白中分子对接，验证Eq与GPER的结合情况，进一步使用雌激素受体抑制剂和GPER受体抑制剂，观察Eq对细胞氧化应激以及PI3K通路和Nrf2蛋白表达的影响。 4.利用绝经后NAFLD大鼠模型，检测各组大鼠的BMD和骨微结构变化，HE染色和油红O染色观察股骨组织学形态学变化，验证Eq的骨保护效应；检测大鼠血清雌激素、TNF-α和IL-6水平，Westernblot和qRT-PCR方法检测肝和骨组织中胰岛素样生长因子-1（Insulin-likegrowthfactor-1，IGF-1）表达水平，探讨Eq骨保护作用可能的机制。 结果 1.与Con组比，Mod组大鼠血脂升高、肝脏脂质累积增多，同时肝组织TAOC、SOD、CAT水平下降，MAD含量增多，氧化应激水平上升；Eq和E2干预可减轻肝脏脂质累积和氧化应激水平，上调肝细胞PI3K、AKT、GSK3β蛋白的磷酸化水平，促进Nrf2及其下游抗氧化基因和蛋白的表达； 2.Eq和E2干预，可以改善油酸钠诱导的HepG2细胞内脂质累积和氧化应激水平，促进PI3K、AKT、GSK3β蛋白的磷酸化，激活Nrf2信号通路及下游抗氧化基因和蛋白的表达； 3.在siRNA沉默Nrf2后，Eq对肝细胞内氧化应激的改善和对Nrf2及其下游抗氧化基因的激活受到了抑制；在抑制PI3K信号通路后，AKT、GSK3β磷酸化水平下降，Nrf2及其下游抗氧化蛋白的表达降低，Eq对氧化应激的改善受到抑制；计算机模拟分子对接显示Eq可稳定结合于GPER蛋白内部；在添加雌激素受体抑制剂或GPER抑制剂后，可使PI3K/AKT/GSK3β通路的磷酸化水平下降，Nrf2及其下游抗氧化蛋白的表达降低，Eq对氧化应激的改善受到抑制。 4.Mod组大鼠BMD水平较对照组显著下降，骨显微结构破坏严重，骨组织内脂肪累积明显，提示绝经后NAFLD大鼠合并骨损伤；Eq和E2干预能显著升高大鼠BMD水平，改善骨显微结构，减轻骨组织脂质累积；Eq和E2能提高循环雌激素水平，降低大鼠血清TNF-α、IL-6水平，提高肝和骨组织IGF-1蛋白和mRNA表达水平。 结论 1.Eq可减轻绝经NAFLD大鼠肝脏中脂质累积，并可通过PI3K/AKT/GSK3β轴上调Nrf2及其下游抗氧化基因的表达，改善肝脏氧化应激反应； 2.Eq可改善油酸钠诱导的HepG2细胞中的脂质累积和氧化应激反应；Eq对氧化应激的调控机制，可能是经雌激素受体和GPER介导，进而促进PI3K/AKT/GSK3β磷酸化并激活Nrf2信号通路； 3.Eq可改善绝经后NAFLD大鼠的骨密度下降，具有骨保护作用，其部分机制可能与Eq降低炎症反应、促进IGF-1在肝和骨组织中表达有关。
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