摘要
目的：病理性心肌肥大是由各种损伤刺激因子和持续压力负荷引起的代偿性心脏扩张。长期心肌肥大是导致心律失常、心力衰竭甚至猝死的病理因素之一。目前治疗心肌肥大并没有有效的策略。线粒体相关内质网膜（ mitochondria associated endoplasmic reticulum membranes, MAMs）作为内质网与线粒体的连接结构，参与细胞内钙稳态、线粒体代谢、线粒体自噬等过程。研究表明MAMs异常与多种疾病发生有关，但是MAMs在心肌肥大中的机制研究较少。因此，本研究旨在探究MAMs是否参与心肌肥大的发生以及线粒体融合蛋白2（mitofusin2, Mfn2）是否通过调节MAMs和胞质钙离子（calcium, Ca2+）抑制心肌肥大的发生。 方法：在动物实验中，Mfn2敲除小鼠模型和血管紧张素II（angiotensin II, Ang II）诱导的心肌肥大小鼠模型构建成功后，使用小动物超声仪检测小鼠心脏功能；通过苏木素-伊红（hematoxylinamp;eosin, Hamp;E）染色检测小鼠心脏病理状态，麦胚凝集素（wheat germ agglutinin, WGA）染色检测心肌细胞表面积；采用实时荧光定量PCR （real time-quantitative PCR, RT-qPCR）检测心肌肥大基因心钠肽（atrial natriuretic peptide, ANP）、脑钠肽（brain natriuretic peptide, BNP）、β-肌球蛋白重链（β-myosin heavy chain,β-MHC）的水平。在细胞实验中，采用蛋白免疫印迹（Western Blot）和RT-qPCR检测Ang II处理后Mfn2蛋白和mRNA表达水平。四甲基异硫氰酸罗丹明（tetramethyl rhodamine isothiocynate, TRITC）标记鬼笔环肽染色和RT-qPCR检测感染Mfn2病毒和转染小干扰RNA（small interfering RNA, siRNA）后心肌细胞的表面积和心肌肥大基因表达的变化；使用Western Blot检测Ang II处理后MAMs标志性蛋白的水平；线粒体和内质网荧光探针检测过表达Mfn2对细胞中MAMs形成的影响；通过 2′, 7′-二氯荧光素二乙酸酯（ 2'', 7''-Dichlorodihydrofluorescein diacetate, DCFH-DA）和Flou-4, AM荧光探针分别检测过表达Mfn2后细胞中活性氧（reactive oxygen species, ROS ）和胞质Ca2+的水平。最后，采用RT-qPCR检测钙调蛋白（calmodulin, CaM）拮抗剂（Calmidazolium chloride）对心肌肥大基因表达的影响。 结果：与Mfn2flox/flox对照组小鼠相比，Mfn2敲除小鼠出现明显的心肌肥大和心脏功能障碍；与Ang II处理小鼠相比，Ang II处理的Mfn2敲除小鼠出现上述现象并没有那么明显。新生大鼠原代心肌细胞经Ang II处理后，Mfn2表达量呈时间依赖性下调；TRITC标记鬼笔环肽染色和RT-qPCR结果显示，敲低Mfn2促进Ang II引起的心肌细胞表面积增大和ANP、BNP以及β-MHC肥大基因的上调，而过表达Mfn2抑制Ang II引起的上述心肌肥大指标的的上调；Western Blot结果显示新生大鼠原代心肌细胞经Ang II处理后，MAMs标志蛋白三磷酸肌醇受体（inositol1, 4, 5-trisphosphate receptor, IP3R）、FUN14域蛋白1（FUN14 domain-containing protein 1, FUNDC1）、磷酸弗林酸性簇分选蛋白2（phosphofurin acidic cluster sorting protein 2, PACS-2）表达量呈时间依赖性下调；线粒体和内质网荧光探针结果显示过表达Mfn2抑制Ang II诱导的MAMs的减少；DCFH-DA和Flou-4, AM荧光探针结果显示，过表达Mfn2抑制Ang II诱导的细胞中ROS和胞质Ca2+的增加。而RT-qPCR结果显示CaM拮抗剂抑制Ang II或敲低Mfn2诱导的心肌肥大基因的上调。 结论：在动物水平，敲除Mfn2能加重Ang II诱导的心肌肥大和心脏功能障碍；在细胞水平，探究了Mfn2通过调节MAMs和胞质Ca2+抑制心肌肥大的作用及机制。我们的研究结果揭示了Mfn2介导的心肌肥大病理机制，为心肌肥大以及持续性心肌肥大导致的心血管疾病提供有效的预防和治疗策略。
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