摘要
感染性疾病至今仍是危害人类健康的全球性公共卫生问题。目前培养法和PCR(Polymerase Chain Reaction)检测病原是诊断的金标准，但具有敏感性低的缺点。基于二代测序的病原快速诊断具有通量大、敏感性高的特点，近年来被广泛应用于临床。然而，检测实验室之间mNGS(metagenomic next-generation sequencing)建库及分析流程差异对呈现报告一致性及疾病的诊疗产生干扰。本研究旨在使用真实临床样本评估mNGS检测的室间差异，分析影响mNGS结果的关键因素，为选择合适的检测条件及报告的解读提供参考。 1 目的： 1.1 探究不同实验室之间mNGS检测差异并比较mNGS与传统方法之间差异; 1.2 探究各实验室测序结果差异涉及的主要因素; 1.3 对mNGS的临床应用提出指导意见。 2 方法： 本研究纳入100例可疑上呼吸道感染患者及24例可疑血流感染患者并采集支气管肺泡灌洗液(BALF)样本以及血液样本。所有样本均经过传统方法(培养及PCR)检测，同时分发至三家实验室进行高通量宏基因及宏转录组检测，其中血液样本仅进行宏基因检测。研究以描述性分析为主。首先以传统检测结果为标准，评估各实验室mNGS检测对部分常见病原的特异性和敏感性。对于传统检测所覆盖范围之外的微生物则分析实验室间mNGS检出的微生物种类的一致性。此外，通过构建本地生信分析流程，使用支气管肺泡灌洗液及血液样本的原始测序数据，比较了不同实验室的建库方式、测序读长以及分析流程差异对结果的mNGS结果一致性的影响。同时，分析样本的宏转录组测序报告，评估基于RNA测序的方式对病原快速诊断的贡献。最后，使用患者的炎症相关临床指标，结合病原序列数评估患者状态、感染程度对mNGS病原检出的影响。 3 结果： 与传统检查结果相比较，支气管肺泡灌洗液样本中，mNGS在部分常见病原的检出的敏感性总均值为64.6％;特异性总均值为96.6％。而血液样本中，各实验室在常见病原的检出敏感性总均值为29.1％;特异性均为100％。各实验室的阴性一致率位于6.8％-60％之间。 三间实验室的mNGS检测在属水平上（Genus）共报告了 125种病原，其中在所有样本中结果能达到完全一致的微生物仅4种。检出一致率高于50％的微生物有9种，一致率为0的微生物多达90种。 根据序列分析结果，3个实验室均具有较高的Q20和Q30 reads比例;人源序列占比较高，去宿主核酸处理的效果还有待提高;不同的比对方法会影响物种检测和鉴定;同时，读长大于70bp的数据分类效果优于50bp以下的数据。 在测序方法的选择上，各实验室宏转录测序结果显示仅9％、18％及6％的样本通过该测序方法可增加检测潜在病原的阳性率。 感染程度对mNGS病原检出呈正趋向影响，但无明显室间差异。 4 结论: 各实验室在常见病原体的检测上都具有较高的特异性和敏感性。在传统检测阴性的标本中检测一致率明显下降，且与标本类型相关。各实验室对病原体的检测和判断存在明显差异，差异可能来源于不同的建库和比对方法，这使单个实验室的结果可信度有所下降。mNGS检测对传统检测起到一定的补充作用，尤其在轻症感染的病原检测上，但仍无法完全取代。宏转录组检测仅对RNA病原具较大检测效能。mNGS在轻症感染中表现稳定，感染程度对mNGS病原检出呈正趋向影响，但对各实验室间的影响差异不大。
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