摘要
‘聊红’椿是臭椿的一个新品种，因果色艳丽，观赏价值高，值得我们深入研究。由于目前‘聊红’椿果色调控机制不明，关于臭椿遗传转化方面的报道甚少。本研究以‘聊红’椿的嫩叶、果荚、花蕾为外植体优化了‘聊红’椿的再生体系；通过根癌农杆菌介导建立了‘聊红’椿遗传转化体系，并构建一转录因子基因DN16609的Cas9基因编辑载体，成功将目标基因的载体转入植物体内；通过对‘聊红’椿果色调控相关microRNA（miRNA）的分离鉴定，发现多个与植物色素相关的代谢途径及其基因受到miRNA调控，为进一步探索‘聊红’椿果色调控机制奠定基础。主要研究结果如下： 1.优化了‘聊红’椿再生体系 以‘聊红’椿的嫩叶、果荚、花蕾为外植体，通过不同的消毒方式对外植体消毒，得出不同外植体的消毒方式不同诱导率不同；经过外植体的筛选得到最佳外植体为嫩叶；通过不同激素组合对‘聊红’椿愈伤组织诱导、芽诱导、根诱导的影响，得到最佳愈伤组织诱导培养基为在MS培养基上添加0.1mg/L6-BA、0.1mg/L2,4-D、0.1mg/LNAA，嫩叶愈伤诱导率为85.16%，生长情况最好。最佳芽诱导培养基为在MS培养基上添加0.05mg/LTDZ、0.5mg/LIBA，不定芽诱导率达到83.88%；最佳芽增值培养基为在MS培养基添加0.1mg/LIBA、1.0mg/L6-BA增值倍数较高；最佳生根培养基为在1/2MS培养基上添加1.3mg/LIBA生根率最高，成功培养出了‘聊红’椿再生苗，‘聊红’椿再生体系初步建立，为遗传转化体系的建立提供技术基础。 2.建立了‘聊红’椿遗传转化体系 通过携带GUS基因的农杆菌侵染‘聊红’椿嫩叶和愈伤组织，探索不同因素对遗传转化过程的影响，得出菌液浓度OD600=0.6时侵染8min共培养2d转化率最高；头孢霉素浓度为300mg/L时抑菌效果最好；潮霉素筛选愈伤组织时最佳浓度为12mg/L，筛选嫩叶时10mg/L效果最佳；经GUS染色验证嫩叶呈蓝色，表明我们成功建立了‘聊红’椿遗传转化体系，为‘聊红’椿果色基因功能研究奠定基础。 3.成功将转录因子基因DN16609基因编辑载体转化到‘聊红’椿愈伤组织 通过课题组前期对转录组的研究找到了在红色翅果中显著上调的转录因子DN16609，本研究通过CRISPR/Cas9技术构建了pCRI-DN16609载体，利用本研究探索到的遗传转化体系的最佳条件，将目的基因通过农杆菌介导转入植物体内，通过潮霉素引物和特异性引物进行PCR验证获得目的条带，目的基因成功转入愈伤组织，为该基因功能验证奠定了基础。 4.分离鉴定‘聊红’椿果色调控相关miRNA 为了进一步探索‘聊红’椿的果色调控机制，本研究通过对‘聊红’椿红色翅果不同阶段及绿色翅果中microRNA进行分离鉴定，共鉴定到294个microRNA，部分microRNA在‘聊红’椿红色翅果中表达量显著变化，并通过定量荧光PCR验证miR396g-5p和miR166e-3p表达量与microRNA测序结果相同，表明二者可能在果色形成过程中发挥重要作用。进一步通过miRNA差异分析和靶标基因富集分析发现多个与植物色素相关的代谢途径及其基因受到miRNA调控，其中包括多个与植物色素合成、代谢及其调控相关的基因，为‘聊红’椿果色基因的研究提供技术支持。
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