摘要
细胞凋亡是动物细胞中维持细胞生存和死亡平衡的程序性死亡。长期以来，细胞凋亡被认为是防止肿瘤出现的重要机制，因此诱导细胞凋亡有助于癌症治疗。然而，细胞凋亡信号是复杂的，它受到多个水平的调控。其中Twist1蛋白在细胞凋亡的信号通路中发挥至关重要的作用。Twist1是基本螺旋-环-螺旋转录因子Twist亚家族的高度保守成员，研究表明，Twist1还可作为核因子NF-κB调节的细胞免疫和炎症反应的关键调控因子。NF-κB途径长期以来一直被认为是一种典型的促炎信号传导途径。然而，在细胞内，CypA通过增强NF-κB核易位和转录活性，从而增加促炎细胞因子的产生，有助于维持NF-κB中p65亚基的稳定性。因此，我们推测CypA与NF-κB介导Twist1的信号通路可能存在一定的联系。因此，本研究主要探究CypA对Twist1的稳定性和其在细胞内功能的调控，进一步扩展了Twist1翻译后修饰和下游靶基因转录的生物学功能，为开发针对CypA与Twist1治疗癌症的临床方法奠定了基础。主要获得以下研究结果： 一、CypA促进Twist1-p65的相互作用和核积累 之前的研究已经证明，CypA对SeV诱导的NF-κB信号通路的激活至关重要。此外，先前的研究指出，CypA与NF-κB的亚基p65相互作用。然而p65增加了Twist1的核表达，并在TNF-α刺激后与Twist1相互作用。本实验进一步对CypA是否通过NF-κB信号通路调节Twist1的表达进行了探索。本实验首先实验验证了CypA促进TNF-α和IL-1β激活NF-κB信号通路。进而利用免疫共沉淀、间接免疫荧光等实验方法，以探索CypA对Twist1-p65的相互作用的影响。免疫共沉淀分析显示过表达CypA促进Twist1-p65相互作用及复合物的形成。在A549-WT（A549/CypA+）细胞和用shRNA敲除CypA的A549（A549/CypA?）细胞中转染p65的siRNA（sip65），在激光共聚焦显微镜下观察Twist1-p65复合物的核积累。结果表明CypA通过p65调节Twist1的亚细胞定位。这些结果共同表明，CypA增加了Twist1-p65复合物的形成和核积累。 二、CypA与Twist1相互作用，促进Twist1的转录活性 通过荧光素酶报告基因系统检测实验发现，过表达CypA显著提高了Twist1的转录活性。在CsA处理后的A549/CypA?或A549/CypA+细胞中，Twist1报告荧光素酶活性被显著抑制。在蛋白表达水平上，在A549细胞中内源性CypA与Twist1发生相互作用，并且这种相互作用依赖于CypA的PPIase酶活性。在翻译后修饰水平上，Twist1的细胞核和细胞质易位是一种重要的表现形式。本实验将A549细胞进行间接免疫荧光分析，实验发现，CypA能调控Twist1的亚细胞定位。以上结果共同表明CypA是Twist1转录活性的关键调节因子。 三、CypA调节CDH1和CDH2基因表达依赖于Twist1的调控 利用Twist1的siRNA（siTwist1）或siRNA阴性对照（siNeg）转染的A549/CypA+和A549/CypA?细胞进行qPCR实验，结果显示，与A549/CypA+细胞相比，A549/CypA?中CDH1的表达显著增加，CDH2的表达显著降低。然而CDH1和CDH2基因表达的这种差异，在siTwist1转染的细胞中或在Twist1表达功能丧失的细胞中（Twist1-ΔDBD）差异不显著，但在野生型细胞中差异显著。以上结果表明，CypA对CDH1和CDH2的转录水平调节依赖于Twist1转录活性。 四、CypA通过调控Twist1蛋白介导A549细胞凋亡 通过检测A549细胞在蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺（CHX）存在下的存活情况来评估CypA-Twist1信号通路调节A549细胞死亡的能力。实验发现，与A549/CypA+细胞相比，CHX处理显著降低了A549/CypA?细胞的存活。然而，在Twist1过表达的A549/CypA?细胞中，CypA对细胞活力的影响增加。通过荧光显微镜分析细胞核来检测A549细胞的死亡是否是由细胞凋亡引起的。实验发现，在没有CHX的情况下，没有检测到显著的细胞凋亡诱导；而CHX处理显著诱导了A549/CypA?的细胞凋亡，其表现出更明亮的核收缩，这与异常的DNA染色质凝聚和核断裂有关。此外，Twist1的过表达减少了A549/CypA+细胞DNA的异常浓缩，表明CypA-Twist1信号通路增强了A549细胞的活力并抑制细胞凋亡。此外通过实验发现，与A549/CypA+细胞相比，A549/CypA?细胞中凋亡标志物Caspase-3水平显著升高，表明CypA-Twist1信号通路调节A549细胞的活力和凋亡。 五、CypA调控Twist1的磷酸化和泛素化过程 通过检测A549/CypA?细胞和A549/CypA+细胞中Twist1磷酸化的情况，发现CypA基因的敲低以剂量依赖的方式显著降低了Twist1Ser68位点的磷酸化。然而，CypA的过表达以剂量依赖的方式显著增加了Twist1Ser68位点的磷酸化，表明CypA促进了A549细胞中Twist1Ser68位点的磷酸化。利用免疫共沉淀实验进一步证实，CypA的过表达能抑制Twist1的降解并显著降低Twist1的泛素化。此外，实验发现CypA能够抑制外源以及内源性Twist1的K48连接的泛素化修饰，而非K63连接的泛素化。总之，CypA通过抑制Twist1的K48连接的泛素化来稳定Twist1蛋白。
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