摘要
斑叶是自然界中常见的叶色变异类型，在园林绿化中具有重要的观赏价值，同时也是研究叶色变异机制的理想材料。因此，揭示斑叶的形成机制对于林木叶色的遗传改良有着重要的意义。RNA甲基化N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine,m6A)作为mRNA的主要的表观修饰，广泛地参与调控植物的多个生物学过程。灰楸(Catalpa fargesii Bur.)属于中国的乡土用材树种，具有观赏和药用等价值。‘麦缘锦楸’是灰楸的天然变异株，同时也是课题组选育的新品种，与灰楸具有相同的遗传信息，但其边缘叶片呈现黄色，中间淡绿的表型特征，推测可能是表观遗传修饰在灰楸斑叶形成中发挥重要作用。本研究以‘麦缘锦楸’不同叶色分区叶片及灰楸对应分区部位的叶片为试验材料，通过m6A修饰组学和分子生物学方法，揭示m6A甲基化修饰在灰楸斑叶形成的修饰特征和作用机制。具体研究结果如下: (1)灰楸叶片的m6A甲基化修饰图谱绘制和特征分析发现，m6A修饰在灰楸20条染色体上均有分布，但在7号染色体上分布密度最高，18号染色体分布密度最低。大部分mRNA只有单一的m6Apeak修饰，主要分布在3'' UTR区域和终止密码子附近。灰楸叶片的m6A修饰更倾向于植物特有的UGUAY(Y代表C/U)基序和保守的RRACH(R代表G/A,H代表A/C/U)基序。对‘麦缘锦楸’和灰楸的m6A甲基化修饰差异基因进行分析:‘麦缘锦楸’黄叶特有差异m6A修饰基因YLSGs(Yellow-Leaf Specific m6A Genes)主要富集在光合作用天线蛋白、类胡萝卜素合成和苯丙烷代谢等途径;淡绿色叶片部分特有的差异m6A修饰基因GLSGs(Green-Leaf Specific m6A Genes)主要富集到类黄酮代谢、花青素代谢途径和淀粉与糖代谢等代谢途径。‘麦缘锦楸’的色素代谢、光合和能量代谢途径相关基因的m6A甲基化修饰可能对斑叶的形成发挥着重要的调控作用。 (2)转录组调控网络图分析发现，‘麦缘锦楸’黄叶的产生可能跟叶绿素的降解，光合作用的降低和类胡萝卜素含量改变有关。在‘麦缘锦楸’叶绿素代谢过程中，叶绿素a合成基因CfChIH，CfChIM,CfPOR和CfCAO显著下调，叶绿体降解的CfCCR基因显著上调加速了叶绿素的降解，造成总叶绿素含量降低。同时，光合系统Ⅱ的CfPsbA、CfPsbB、CfPsbC和 CfPsbE以及光合系统Ⅰ的CfPsak在灰楸斑叶中显著下调，抑制叶片光合作用的正常进行。此外，参与类胡萝卜素合成途径的CfNCED、CfVDE和CfCCD显著上调，提高了叶片中叶黄素含量。推测叶绿素合成受阻、光合受限和叶黄素含量增加可能是造成灰楸斑叶的色素分布不均匀的直接原因。 (3)m6A富集水平与基因表达水平之间的相关性分析显示，m6A修饰与转录本倾向于负相关。m6A修饰差异基因主要富集到光合代谢、叶绿素发育、类胡萝卜素代谢和类黄酮的合成途径。此外，m6A甲基化修饰的转录因子bHLH,NAC和WRKY在黄色叶中均下调表达，MYB和WRKY甲基化修饰转录因子在淡绿叶中也显著下调表达。 (4)结合基因组和转录组数据分析，灰楸甲基转移酶CfMTA1和CfMTA2表达量在麦缘锦楸和灰楸不同叶色分区并未发生显著变化。灰楸基因组中含有5个潜在的m6A去甲基化酶基因CfALKBH1-CfALKBH5,其中，‘麦缘锦楸’叶片中CfALKBH5基因的表达量显著低于灰楸对应部位，推测CfALKBH5可能通过调控m6A甲基化修饰的水平变化，进而影响‘麦缘锦楸’叶色的形成。亚细胞定位分析证实CfALKBH5定位于细胞核内。与空载对照植株相比，CfALKBH5基因被抑制后叶片出现褪绿表型，并且褪绿叶片的m6A甲基化修饰水平升高，叶绿素含量下降但类胡萝卜素含量没有显著变化。此外，在色素和光合合成通路中发挥关键作用的CfCAO、CfVDE和CfPsbP基因出现了显著下调表达。进一步证实了灰楸m6A去甲基化酶CfALKBH5基因参与调控叶色的形成。 以上研究结果表明，在灰楸叶片中存在大量的mRNAm6A修饰，这些甲基化修饰基因主要参与色素代谢、光合作用和能量代谢等过程。CfALKBH5是‘麦缘锦楸’和灰楸不同叶色分区中显著差异表达的m6A去甲基化酶基因，抑制其表达可使灰楸叶片出现褪绿表型。本研究从m6A表观遗传调控方面筛选了影响灰楸斑叶形成的关键差异基因，为调控叶色变化的机制研究提供了新见解。
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