摘要
灰葡萄孢(Botrytiscinerea)引起的人参灰霉病是人参主要病害之一。在生产中，人参灰霉病多采用化学药剂的方法进行防治，这种传统的防治方法往往导致人参和土壤中农残均超标。常规的病原菌检验方法往往需要花费较长的时间才能完成，无法实现早期防治。因此，建立一种高效、快速、准确的检测方法，用于早期检测人参灰葡萄孢菌，对预防和控制人参灰霉病具有重要意义。基于分子检测技术的广泛应用，本研究拟建立一种新的病原菌核酸提取技术，结合PCR-核酸传感器（PCR-NAS）快速检测系统，实现对人参灰葡萄孢菌的快速检测，可能为人参灰霉病的早期防治提供一种新的检测技术。具体结果如下： 1.核酸提取作为样品前处理过程，对最终检测分析结果的准确性起到决定性影响。本研究基于核酸提取方法和试剂的研究，建立了一种基于磁珠法真菌基因组DNA提取技术，该方法获得的DNA样本纯度高、得率高，并且可有效去除腐殖酸等PCR抑制剂，能更好地适应下游PCR检测。 2.本研究采用新开发的核酸提取方法和小型核酸自动提取仪对真实样品进行DNA提取，结果显示，核酸提取程序R1提取的平均DNA浓度为416.97ng/μL，CtMean为17.9；核酸提取程序R2提取的平均DNA浓度为277.01ng/μL，CtMean为19.9。因此，本研究中将核酸提取程序R1与小型核酸自动提取仪联用，可在35分钟内同时提取96个DNA样本。 3.本研究建立一种PCR-核酸传感器(PCR-NAS)快速检测技术。该方法特异性强、灵敏度高、重复性好，对Botrytiscinerea基因组的检出下限为1pg/μL，且与其他人参病原菌无交叉反应产生，批内和批间重复性的CV小于11.4%。 4.本研究利用PCR-NAS和qPCR检测技术对人工模拟样本进行检测，结果表明，两种方法均能在接种6小时后的人参叶片中和接种12小时后的人参土壤中检测出Botrytiscinerea。通过PCR-NAS对田间真实样本进行检测，结果表明，在50例田间人参根际土壤样本中，20份患病土壤全部检出，30份健康土壤中检出5例阳性样本。在50份田间人参叶片样本中,20份患病叶片全部检出，30份健康叶片中检出12份阳性样本。这些结果表明，本研究开发的检测技术具有较高的特异性和高灵敏度。
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