摘要
目的：糖尿病视网膜病变（Diabeticretinopathy,DR）是糖尿病的主要血管并发症，其发病机制尚未完全阐明。使用定量蛋白质组学技术分析非增殖期和增殖期DR患者血浆及其细胞外囊泡（Extracellularvesicles,EVs）的蛋白质表达谱，并与无DR的糖尿病人群相比，筛选出与DR发病机制密切相关的蛋白，寻找DR的生物学标记物，探寻DR发生的机制和潜在治疗靶点。 方法：1.血浆EVs的分离与鉴定：采取差速超速离心法分离1.5ml血浆中的小细胞外囊泡（smallEVs,sEVs）和大细胞外囊泡（largeEVs,lEVs）。考马斯亮蓝染色分析血浆，sEVs与lEVs整体的蛋白分布。Westernblot验证sEVs高表达外泌体特征性蛋白CD63、CD9、TSG101。纳米粒度分析仪分析sEVs与lEVs的粒子直径分布。透射电子显微镜鉴定所分离sEVs与lEVs的形态学特征。 2.受试者分组及基线信息采集：收集2018-2019年来我院就诊的患者血浆样本。根据全身状况和眼底表现分为四组：健康人群，无眼底改变的糖尿病组（以下简称DM），非增殖性糖尿病视网膜病变组（non-proliferativediabeticretinopathy,NPDR），增殖性糖尿病视网膜病变组（proliferativediabeticretinopathy,PDR）。每组选取性别年龄匹配的6人，收集血浆，收集受试者病历信息及实验室检查生化数据。 3.定量蛋白组学分析血浆及其细胞外囊泡的蛋白质谱：三种成分各取适量蛋白，分别进行蛋白变性，还原，酶切。对样品进行LC-MS/MS检测，使用SWATH-MS方法进行蛋白定量，采取R语言进行生物信息学分析，筛选可信蛋白及差异蛋白，并对差异蛋白进行基因注释和通路富集分析。 4.差异蛋白表达水平验证：用ELISA验证S100钙结合蛋白A8（S100CalciumBindingProteinA,S100A8）在玻璃体，血浆，血浆sEVs和lEVs的表达情况，同时检测该批玻璃体中TNFα的表达水平。在体内研究中，选取STZ诱导的糖尿病大鼠视网膜进行验证。免疫组化观察S100A8在视网膜的表达，Westernblot验证S100A8和TNFα在糖尿病大鼠视网膜中表达情况。 结果：1.本研究采取差速超速离心法，从1.5ml血浆样本中成功分离出sEVs与lEVs。Westernblot结果表明sEVs表达CD9，CD63，TSG101，lEVs表达量较少，血浆中则未检测到。血浆中高丰度蛋白ApoA1在sEVs与lEVs中表达较少。TEM和NTA鉴定lEVs直径较大呈圆形，sEVs直径较小，呈双层茶托样。 2.参与本研究的受试者临床信息分析，年龄、性别、体重、胆固醇、尿素、肌酐、甘油三酯等无统计学差异。 3.蛋白质组学结果显示，血浆，lEVs与sEVs总鉴定数分别为：1701，1722，2166。根据标准筛选差异蛋白后，血浆，lEVs与sEVs各自的差异蛋白分别为：104，395，264。血浆差异蛋白主要富集通路有：血小板活化，信号传导和聚集，补体和凝血级联，GPVI介导的激活级联等。lEVs主要富集通路有：补体和凝血级联，胰岛素样生长的调节因子运输和胰岛素样生长吸收因子结合蛋白等。sEVs主要富集通路有血小板脱粒，补体凝血级联，初始补体激活，先天免疫系统等。 4.ELISA验证S100A8表达水平：S100A8在PDR患者血浆sEVs中表达较NPDR，DM和NC组升高（F=6.185,P=0.039,0.020,0.002），而血浆和lEVs中没有显著差异（F=0.015,0.283,P=0.998,0.838），与蛋白质谱结果的趋势相同。玻璃体的ELISA结果显示PDR患者表达S100A8水平较NPDR组及DM，NC组高，差异有统计学意义，（F=19.500,P=0.002,P＜0.0001,＜0.0001），并且PDR患者玻璃体TNFα表达水平较DM组和NC组升高（F=10.700,P=0.006,P=0.001）。 5.STZ诱导的糖尿病大鼠，血糖持续升高，体重减轻，表示造模成功。五个月时，HE染色显示视网膜内核层出现异常血管，视细胞形态异常。免疫组化结果显示神经节细胞表达S100A8蛋白，内核层、外核层均见S100A8阳性细胞。WesternBlot结果显示糖尿病大鼠视网膜S100A8和TNFα表达水平升高（t=8.028,8.921,P=0.0013,0.0009）。 结论：1.血浆sEVs与lEVs具有不同的直径，蛋白分布及形态特征。血浆含有高丰度蛋白，sEVs与lEVs蛋白分布均匀具有很高的研究价值。 2.通过血浆，sEVs与lEVs三组成分的质谱分析得出sEVs鉴定数最多，即含有更丰富的蛋白，更适合做蛋白质谱分析和生物标志物检测。 3.DR患者血浆，sEVs与lEVs整体蛋白表达具有一定的重合，但在DR中的差异蛋白重合较少。血浆，血浆sEVs与lEVs可以分别反应DR不同方面的疾病变化，具有极大的研究潜力。 4.循环sEVs炎症相关蛋白S100A8可以作为糖尿病视网膜病变严重程度的潜在生物标志物。
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