摘要
鲜切果蔬因新鲜、方便、卫生、营养等优点，已逐渐成为果蔬消费的重要组成部分。但鲜切产品较完整果实更易发生品质劣变，损失严重。当前限制鲜切果蔬保鲜新技术开发的最主要因素是对果蔬伤胁迫响应关键基础理论仍缺乏深层次的认识。酚类物质是果蔬中最重要的抗氧化物质之一，在鲜切果蔬损伤修复中发挥重要作用，酚类物质合成积累是多种果蔬伤胁迫响应中最显著的反应之一。研究表明，酚类物质合成与乙烯信号分子的调节密切相关，但相关研究大多集中在乙烯信号对酚类物质积累这一终端反应的直接调控，其对酚类物质合成的转录调控作用亟待深入研究。乙烯响应因子（Ethylene response factors，ERFs）是乙烯信号通路末端的关键转录因子，在植物伤胁迫应答及次生代谢产物合成中发挥重要作用，但其参与鲜切果蔬酚类物质合成的转录调控机制尚不清楚。 本论文以火龙果果实为实验材料，以乙烯信号通路在鲜切火龙果酚类物质合成中的作用为核心研究内容，首先运用生物信息学分析手段，筛选获得了可能调控鲜切火龙果酚类物质生物合成的 HuERF1 等关键转录因子；再结合外源乙烯及其受体抑制剂1-甲基环丙烯（1-Methylcyclopropene，1-MCP）预处理，明确了乙烯在鲜切火龙果酚类物质合成中的作用；通过对内源乙烯合成及其信号转导关键基因表达的分析，发现外源乙烯诱导的鲜切火龙果酚类物质合成与乙烯信号转导途径密切相关，且HuERF1在此过程中发挥重要作用；进一步利用凝胶阻滞迁移实验（Electrophoretic mobility shift assay，EMSA）和双荧光素酶报告基因实验（Dual luciferase reporter assay，DLR）分析了 HuERF1 对酚类物质生物合成关键途径苯丙烷代谢相关靶基因的调控作用。主要研究结果如下： （1）鲜切火龙果酚类物质合成中关键调控基因的生物信息学分析。以贮藏初始、早、中、末期（W0h，W6h，W24h，W48h）的鲜切火龙果为研究对象，分析验证了总酚含量和乙烯等信号物质在鲜切火龙果中的变化规律。进一步利用加权基因共表达网络分析（Weighted gene co-expression network analysis，WGCNA）等生物信息学分析手段，系统揭示了参与鲜切火龙果酚类物质合成关键基因的变化规律，并筛选得到可能调控鲜切火龙果酚类物质合成的 HuERF1 等关键转录因子。结果表明，鲜切火龙果酚类物质合成与初级代谢、次级代谢及乙烯等信号转导途径的基因调控密切相关，且 HuERF1 等转录因子可能参与该过程的转录调控。 （2）研究了乙烯和1-MCP预处理对鲜切火龙果酚类物质合成积累的影响。结果发现，乙烯预处理通过提高苯丙烷代谢关键酶（苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonia lyase，PAL）、肉桂酸-4-羟基化酶（Cinnamic acid 4-hydroxylase，C4H）、4-香豆酸辅酶 A 连接酶（4-coumarate-CoA ligase，4CL））活性及相关基因表达，促进总酚、总黄酮和绿原酸、没食子酸、原儿茶酸、根皮苷和山奈酚等酚类化合物的积累，增强了鲜切火龙果的抗氧化能力。而 1-MCP预处理抑制了PAL、C4H、4CL的活性及其基因表达，延缓了鲜切火龙果酚类物质积累及抗氧化能力的增强。表明乙烯通过调控苯丙烷代谢途径关键酶活性及基因表达，参与鲜切火龙果酚类物质合成积累。 （3）研究了乙烯和1-MCP预处理对鲜切火龙果乙烯信号转导途径的影响。结果发现，乙烯预处理抑制了鲜切火龙果中内源乙烯的产生，但促进了乙烯关键受体基因（HuETR1和HuETR2）及其下游转录因子基因（HuEIN3s和HuERF1s）的上调表达，以及乙烯负调控因子基因（HuCTR1s）的下调表达。而 1-MCP 预处理对内源乙烯合成无显著影响，但抑制了鲜切火龙果中 HuETR1、HuETR2、HuEIN3s和HuERF1s基因相对表达量的上调，也减弱了伤胁迫对HuCTR1s的抑制作用。表明外源乙烯通过调节乙烯信号转导途径诱导鲜切火龙果酚类物质的合成积累，且其末端转录因子HuERF1在此过程中发挥重要作用。 （4）研究了乙烯信号通路末端关键转录因子HuERF1对鲜切火龙果酚类物质合成中靶基因的调控作用。基于火龙果基因组数据库，克隆获得了HuERF1基因全长CDS序列及酚类物质合成关键基因HuPAL、HuC4H、Hu4CL的启动子。进一步EMSA和DLR实验结果显示，HuERF1能够靶向结合HuPAL和HuC4H启动子的GCC-box顺式作用元件并激活其转录活性，但未发现其对Hu4CL的靶向调控作用。
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