摘要
【目的】 基于单细胞数据挖掘探索肝细胞癌（hepatocellularcarcinoma，HCC）的肿瘤异质性和代谢特征，基于代谢变化最显著的亚群构建预后模型并预测潜在的抗HCC的药物。翻译后修饰的改变会导致基因表达的变化，并已被证明会驱动HCC的发生发展。这些变化赋予了癌细胞的生存优势，因此进一步从翻译后修饰出发，基于糖基化（Glycosylation，GLY）评分和肿瘤微环境（TumourMicroenvironment，TME）评分构建GLY/TME分类模型指导HCC患者风险分级并探讨糖基化修饰在免疫治疗中的疗效，为HCC患者的个体化治疗提供理论基础。 【方法】 1.收集HCC患者的单细胞RNA测序（singlecellRNAsequencing，scRNA-seq）数据和批量RNA测序（bulkRNAsequencing，bulkRNA-seq）数据。这些数据来自癌症基因组图谱（TheCancerGenomeAtlas，TCGA）数据库和基因表达综合（GeneExpressionOmnibus，GEO）数据库。 2.应用Seurat软件包处理scRNA-seq数据，根据CellMarker数据库和文献已报道的标志基因来鉴别细胞亚群，并运用CellChat软件包进行细胞通讯分析以及inferCNV软件包区分肝细胞的恶性与否。 3.应用多种软件包（scMetabolism软件包，clusterProfiler软件包，fgsea软件包，singleseqgset软件包，irGSEA软件包）进行通路富集分析，探索通路异质性。 4.应用limma包筛选差异基因，采用单变量Cox回归分析、最小绝对收缩和选择算子（leastabsoluteshrinkageandselectionoperator，LASSO）分析、bootstrap方法以及多变量Cox回归分析建立预后模型。 5.应用CIBERSORT分析HCC患者中的免疫细胞浸润及相对比例，应用TIP分析了解HCC免疫活动的机制，应用TIDE分析HCC患者对免疫检查点治疗的敏感性。 6.应用oncoPredict软件包进行药物敏感性分析，应用连通图（ConnectivityMap，CMap）预测针对高风险群体的潜在治疗小分子化合物。 7.应用实时荧光定量PCR（QuantitativeReal-timePCR，qRT-PCR）以及Westernblot比较HCC细胞系和正常肝细胞系之间的基因表达水平。应用临床蛋白质组学肿瘤分析联盟（ClinicalProteomicTumorAnalysisConsortium，CPTAC）和人类蛋白质图谱（HumanProteinAtlas，HPA）数据库，比较特征基因在原发肿瘤组织和正常组织的蛋白表达水平。 【结果】 1.在选定的scRNA-seq数据中，总共有58,475个细胞被纳入后续分析。肿瘤细胞的基因表达和拷贝数变异（copynumbervariation，CNV）表现出高度异质性。代谢通路富集分析表明，肝细胞亚群的代谢变化最显著，并且来自肿瘤标本和相应的癌旁标本的肝细胞中的糖代谢和脂质代谢途径之间存在相反的趋势。此外，构建了HCC的细胞间通讯图谱，结果发现在肝脏正常组织和肿瘤组织中，细胞间相互作用存在显著差异。最终，开发了一个基于肝细胞亚群的预后模型，并通过实验验证了预后基因的表达水平。针对高风险组，PHA-00816795和巯基嘌呤被评估为潜在的抗HCC药物。 2.GLY/TME分类模型将HCC患者划分为三个亚型，GLYlow/TMEhigh组，mixed组和GLYhigh/TMElow组，其中GLYlow/TMEhigh亚组的预后及免疫治疗效果最好。在单细胞水平上发现GLY评分在恶性细胞亚群中最高。细胞通讯分析结果显示GLYhigh恶性细胞和基质细胞以及免疫细胞之间的相互作用最强，GLYmedian恶性细胞次之，而GLYlow恶性细胞与其他细胞没有任何互作信息。相关性分析结果显示，GLY评分与PD1和CTLA-4等检查点基因呈显著正相关关系，并且26个免疫检查点基因与糖基化修饰相关预后基因均有关。 【结论】 在HCC中，TME内的多种细胞都发生了广泛的重编程，特别是在转录状态、代谢变化和细胞间相互作用方面。基于单细胞数据所建立的预后模型能有效预测HCC患者的预后情况。这为探索HCC的TME及其异质性提供了新的视角，并为其未来的临床治疗提供了新的治疗靶点以及潜在的治疗药物。GLY/TME分类模型在HCC患者的预后及免疫治疗反应上有良好的预测性能，GLY/TME分类模型可能是未来HCC预后评估和风险分级的一个有力工具，它为HCC的诊断、治疗和预后拓展了独特的思路。
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