摘要
据统计，我国胃癌患者发病率和死亡率在所有类型癌症中均居第三，胃癌死亡人数占全球胃癌人数的一半，总体5年生存率不足50％。目前胃癌治疗方式有限，主要包括手术切除和和化学治疗，胃癌患者生存率依然较低，预后差，易发生转移。近年来，小分子抑制剂已成为胃癌治疗的关键。 组蛋白去乙酰化是调控基因表达和转录的重要表观遗传修饰。组蛋白去乙酰化酶6(Histone deacetylase 6,HDAC6)属于Zn2+依赖性Class Ⅱb 类 HDACs,主要存在于细胞质中。HDAC6作用于α-Tubulin、Cortactin、Foxo1等多种非组蛋白底物，调控肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移，同时影响免疫细胞的分化，抑制抗肿瘤免疫效应，因此HDAC6是多种癌症发生发展的重要促进因素。 首先，本文通过TCGA(The Cancer Genome Atlas)等数据库分析发现，HDAC6在胃癌中的表达水平明显高于健康组织，且HDAC6高表达的患者总体生存期、无进展生存期、首次进展生存期更短。因此HDAC6是胃癌治疗的潜在靶点。本文拟筛选出高选择性、高活性的HDAC6小分子抑制剂，丰富HDAC6抑制剂的结构类型,为胃癌靶向治疗提供先导化合物。 其次，本文基于建立的HDAC1/2/3/6酶活性检测体系，从本课题组的小分子化合物库中筛选得到对HDAC6酶活性具有较好抑制作用的化合物 W-428(HDAC6 IC50=28.61nM)。为进一步确定 W-428的选择性，检测 W-428对HDAC1、HDAC2及HDAC3的酶活性抑制作用,结果表明W-428对三种HDAC的IC5o分别是HDAC6的7.72、3.89和9.74倍，说明W-428对HDAC6具有亚型选择性抑制作用。利用生物膜层干涉(BLI)技术测定了 W-428与HDAC6的平衡解离常数(KD)为510±80 nM,进一步从分子水平证明W-428与HDAC6具有高亲和力。热迁移实验(CETSA)和Western blot在细胞水平上表明W-428能有效靶向抑制HDAC6,并上调α-Tubulin乙酰化水平。MTT实验证明W-428明显抑制胃癌细胞的生长，其中对MGC-803细胞抑制活性最为显著(IC50=2.086±0.202 μM)。Edu实验和克隆形成实验均表明W-428以浓度依赖的方式有效抑制胃癌细胞MGC-803增殖活性。流式细胞术和Western blot证明W-428介导线粒体膜通透性变化，极化线粒体膜电位以启动细胞凋亡，并通过调节凋亡相关蛋白进一步促进胃癌细胞MGC-803凋亡。SwissADME网站预测W-428在体内通过胃肠吸收，其极性、水溶性、亲脂性、分子量、柔性、饱和度均在小分子药物适宜范围。监测分别静脉注射(5mg/kg)和灌胃(20mg/kg)给予大鼠W-428后的血药浓度随时间的变化,结果表明W-428具有较好的药代动力学参数。本文建立了 615小鼠皮下瘤模型，并对W-428的干预效果进行了研究，结果表明，W-428能够显著抑制肿瘤的生长，展现出优异的体内抗肿瘤活性。同时，急性毒性实验表明了 W-428对动物无明显器质性损害，未显示明显的毒副作用。 通过进一步优化，本文得到了更高选择性的喹啉类化合物L-45(HDAC6 IC50=23.83 nM),L-45 对 HDAC1、HDAC2/HDAC3 的 IC50 分别是 HDAC6 的 78 倍和84倍以上，表明L-45对HDAC6具有很高的亚型选择性抑制作用。BLI检测L-45与HDAC6的KD值为160±49 nM,表明L-45对HDAC6的高亲和力。CETSA和 Western blot证明了 L-45能够在胃癌细胞MGC-803内高效靶向HDAC6,并以浓度依赖方式抑制HDAC6去乙酰化活性。细胞划痕和Trans well实验均表明L-45能够显著抑制胃癌细胞MGC-803迁移。Western blot实验证明L-45能够浓度依赖性抑制胃癌细胞的上皮间质转化。RNA-seq结果同时证明，L-45显著影响细胞外基质形成、黏附因子等与肿瘤侵袭迁移相关通路，与上述结果一致。SwissADME网站预测化合物L-45在体内通过胃肠吸收，各系数都在小分子药物适宜的范围内。监测大鼠静脉注射5mg/kg和灌胃20mg/kg化合物L-45后的血药浓度,结果表明化合物L-45显示出更优于化合物W-428的药代动力学参数。 HDAC6蛋白的催化域2(CD2)对于HDAC6乙酰化活性是不可缺少的部分，且CD2的结构对于CD1的去乙酰化活性是必需的。为进一步揭示化合物W-428、L-45与HDAC6 CD2相互作用的结构位点，设计和优化出更加高效的HDAC6抑制剂，本文表达纯化HDAC6 CD2蛋白，并筛选得到其与W-428、L-45的共结晶条件，用以解析其结构。 综上所述，本文从本课题组内设计合成的小分子化合物库，分别筛选得到了新型嘧啶类和喹啉类HDAC6抑制剂，并对其进行了抗胃癌活性评价、类药性、成药潜力研究，为HDAC6抑制剂先导化合物的研究提供思路，及靶向HDAC6用于胃癌治疗奠定理论基础。
NETL