摘要
目的： 运用网络药理学及动物实验验证结合法探讨黄精-当归药对（Huangjing and Danggui drug pair, HDP）治疗阿尔茨海默病（Alzheimer''s disease, AD）作用中的有效成分、关键靶点及分子机制，为黄精丸临床防治AD应用提供实验依据与参考。 方法： 本研究分为两部分进行，包括实验一、网络药理学预测及分子对接分析；实验二、动物实验验证。 实验一、网络药理学预测及分子对接分析 1. HDP有效成分及靶点筛选：运用TCMSP及PubChem数据库对HDP有效成分及其靶点信息进行收集，再以Uniprot数据库完成对各有效成分的靶点名称的核对。 2. AD靶点筛选：分别登录GeneCards、OMIM、PharmGKB、DrugBank、DisGeNET等在线数据库，完成对AD治疗靶点的收集；再将各数据库靶点进行组合统一，然后将各靶点与HDP有效成分靶点进行交集，即可获得HDP有效成分治疗AD的靶点。 3. PPI网络构建：首先利用String11.0数据库获取HDP治疗AD靶点的蛋白互作关系（PPI）数据；然后将数据结果导入Cytoscape 3.8.0软件，以可视化技术展示各靶点PPI，并分析其中的关键核心靶点。 4. GO功能和KEGG通路富集分析：利用DAVID数据库，录入HDP治疗AD靶点，进行GO和KEGG通路富集分析。 5. HDP各成分、靶点蛋白与主要通路的网络关系图构建：将HDP各有效成分及其治疗AD靶点及通路信息录入Cytoscape3.8.0软件，完成“成份－靶点－通路”网络关系图构建。利用Analyze Network插件工具分析网络关系图特征，并确定HDP在发挥治疗AD作用中的主要作用成分、靶点及通路之间相互关系。 6. HDP主要作用成分与靶点蛋白分子对接分析：分别登录PubChem数据库和RCSB PDB数据库下载药物分子及核心靶点蛋白文件，再进行相应的分子对接操作。 实验二、动物实验验证 1. 动物及分组：90只4周龄雄性昆明小鼠，体重(22±2) g，随机分为六组，即正常对照组（简称对照组）、AD模型组（简称AD组）、多奈哌齐组、HDP低剂量（1.75 g/kg/d）组、HDP中剂量（2.5 g/kg/d）组、HDP高剂量（7.5 g/kg/d）组。 2. AD造模及试验药物干预：各组（除外对照组）小鼠先连续3周每天皮下注射1%D-半乳糖液（5 mL/kg），再每日腹腔注射东莨菪碱（2 mg/kg）维持2周，共维持5周。试验药物干预开始于AD造模开始1周后，各试验药物组小鼠每天灌胃多奈哌齐或者HDP提取液各剂量，AD组灌胃0.5 mL/d 无菌N·S，各灌胃共进行4周。 3. 行为学检测：以水迷宫检测各组小鼠学习、记忆的差异以分析试验药物对AD小鼠痴呆症状影响。 4. 病理检测：经HE和尼氏染色，分析各组小鼠大脑（皮层和海马）神经结构及数量变化。 5. 海马PI3K/AKT通路变化检测：以RT-qPCR、Western blot（WB）检测各组小鼠海马PI3K、AKT mRNA及Protein表达水平差异。 6. 海马神经凋亡改变检测：采用免疫组化法检测各组小鼠海马中Bax、Bcl-2、Caspase-9阳性神经元表达差异以检测其凋亡变化。 7. 海马神经干细胞（NSCs）增殖差异检测：采用免疫荧光检测各组小鼠海马DG区BrdU阳性细胞变化以检测其NSCs增殖差异。 结果： 实验一、网络药理学预测及分子对接分析结果 1. HDP有效成分和靶点筛选结果：经筛选后得到符合条件且存在对应靶点的活性成分18个，对应靶点共176个。 2. HDP治疗AD靶点筛选：获得HDP治疗AD的潜在靶点共有150个。 3. PPI网络构建：PPI网络互作图显示HDP存在互相作用的蛋白147个，边数为1682，平均节点度为22.9，平均局部聚类系数为0.584，预期边数为597，PPI浓缩p值lt;1.0×10-16。拓扑学分析得出HDP排名前五的核心靶点依次为AKT1、JUN、TNF、TP53、INS。 4. GO分析：获得HDP生物过程154个，细胞组分77个，分子功能132个。 5. KEGG分析：得到HDP抗AD的信号通路共161条，其中富集靶点数目最多的为PI3K/AKT通路。 6. 药物成分、靶点蛋白与通路的网络图构建：由药物-靶点-通路网络图进行构建和分析得出HDP防治AD的主要作用成份是β-谷甾醇、豆甾醇、芹黄素、异甘草素、黄芩素等五种成分。 7. 分子对接实验：HDP有效成分均可与各核心靶点进行对接，核心靶点中AKT1与各药物分子对接的整体结合能最低；主要有效成分中β-谷甾醇与各核心靶点对接结合能最低；对接结果提示β-谷甾醇为HDP治疗AD的最有效成分， PI3K/AKT信号通路为HDP治疗AD最有效的信号通路。 实验二、动物实验验证结果 1. 行为学差异检测：AD组小鼠的逃避潜伏期（代表学习记忆能力）较对照组明显增加，表明其痴呆较明显（Plt;0.01）；各药物组小鼠逃避潜伏期较AD 模型组明显缩短，其痴呆症状明显改善（Plt;0.05, Plt;0.01），且HDP在1.75-7.5 g/kg/d剂量内呈现较好的剂量依赖关系，证明HDP有效缩短了AD小鼠的逃避潜伏期，提示其改善了AD小鼠的学习记忆障碍，可有效治疗AD。 2. 神经病理检测：AD 模型组小鼠大脑（皮层 S1Tr 区及海马CA1、CA3区）神经元数量较对照组明显减少，且结构分布紊乱，神经元胞质胞核着色不均，胞体肿胀且内部呈空泡样，胞内结构紊乱松散，胞核固缩（Plt;0.01）；各药物组小鼠大脑（皮层 S1Tr区及海马CA1、CA3区）神经数量较AD组有所增加，且结构排列较整齐，神经元胞质胞核着色加深，胞质松散及胞核核仁变性固缩现象明显减轻（Plt;0.05，Plt;0.01），且HDP呈现相同的神经保护药效作用。 3. 海马PI3K/AKT通路活性水平检测：AD组小鼠海马PI3K、AKT mRNA及蛋白表达较对照组均显著降低（Plt;0.01），各药物组小鼠海马PI3K、AKT mRNA及蛋白表达水平较AD组均明显升高（Plt;0.05，Plt;0.01），且HDP激活该通路呈现相同的药效作用。 4. 海马神经凋亡检测：AD组小鼠海马较对照组的CA1、CA3区Bcl-2阳性表达明显降低（Plt;0.01），Bax、Caspase-9 阳性表达明显升高（Plt;0.01，Plt;0.01）；各治疗组小鼠海马较AD组的CA1、CA3区Bcl-2阳性表达明显升高（Plt;0.05，Plt;0.01），Bax、Caspase-9阳性表达明显降低（Plt;0.01，Plt;0.01），且HDP抗神经凋亡也呈现相同的药效作用。 5. 海马NSCs增殖检测：AD组小鼠海马BrdU+细胞较对照组明显减少（Plt;0.01）；各药物组小鼠海马BrdU+细胞较AD组明显增多（Plt;0.05，Plt;0.01），且HDP在1.75-7.5 g/kg/d剂量内其药效作用随剂量增加而增强，表明HDP能促进AD动物海马NSCs增殖。 结论： 1. HDP治疗AD疗效较好。 2. HDP治疗AD的主要成分为β-谷甾醇、豆甾醇、芹黄素、异甘草素、黄芩素等，调控的主要靶点有AKT1、JUN、TNF、TP53、INS等，调控的信号通路有PI3K/AKT、p53信号通路、TNF信号通路、Ca2+信号通路、炎症信号通路、Wnt信号通路等，HDP具有多成分、多靶点、多通路机制防治AD。 3. HDP可通过激活PI3K/AKT信号通路减轻脑内神经凋亡、促进海马NSCs增殖发挥治疗AD作用。
NETL