摘要
目的： 骨肉瘤(osteosarcoma,OS)是最常见的骨原发性恶性肿瘤，严重影响儿童和年轻人的健康。过去的几十年里OS的治疗一直少有突破。因此，根治OS仍然面临很大的考验，探究OS新的治疗方法迫在眉睫。 混合细胞系白血病蛋白1(Mixed lineage leukemia1,MLL1)是组蛋白H3赖氨酸4(Histone H3lysine4,H3K4)甲基化酶的重要组成部分，通过与多发性内分泌腺瘤1型基因(Multiple endocrine neoplasia type1,MEN1)编码蛋白Menin相互作用参与H3K4的甲基化，最终导致致癌基因的转录。小分子Menin抑制剂通过靶向Menin与MLL1相互作用抑制MLL1的甲基转移酶活性，从而在白血病、乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌等癌症中发挥抗癌活性。据报道MLL1在OS中具有致瘤作用，但小分子Menin抑制剂是否具有OS治疗作用仍有待研究。本研究旨在通过体外细胞和体内动物实验评估小分子Menin抑制剂MI-503的抗OS潜力，研究其潜在的抗OS机制。 方法： (1)收集郑州大学第一附属医院2020-2022年病理诊断为骨肉瘤的癌及癌旁样本，免疫组织化学检测H3K4me3的表达。 (2)不同浓度的MI-503作用于143B,HOS,Saos-2,SKES1,MG-63和U2OS细胞7d,用CCK-8法检测细胞活力并计算EC50值。 (3)不同浓度MI-503作用于143B和Saos-2细胞14d,应用克隆形成实验检测两个MI-503敏感骨肉瘤细胞株的增殖情况。 (4)细胞热位移分析(Cellular thermal shift assay,CETSA)实验检测MI-503与Menin蛋白在143B细胞中的结合情况。 (5)不同浓度的MI-503作用于143B细胞48h,通过蛋白免疫印迹实验(western blotting)检测H3K4me1,H3K4me2,H3K4me3的蛋白表达情况。 (6)1μM的MI-503作用于143B细胞24h,48h,72h后，通过反转录-定量聚合酶链反应(Reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测c-Myc和Mcl-1的mRNA表达情况。 (7)不同浓度的MI-503作用于143B和Saos-2细胞72h,通过western blotting方法检测c-Myc,Mcl-1,p27,PARP的蛋白表达情况。 (8)建立143B骨肉瘤异种移植小鼠模型，治疗小鼠13d,对比MI-503和对照组治疗效果，并免疫组织化学分析标本中H3K4me3和Ki67表达。 结果： (1)人骨肉瘤标本免疫组织化学结果显示，癌组织中H3K4me3的表达高于癌旁组织(p＜0.01)。 (2)CCK-8结果显示，不同浓度MI-503处理6种OS细胞7d后，呈剂量依赖性的抑制细胞的生长。 (3)克隆形成实验结果显示，不同浓度MI-503处理143B和Saos-2细胞14d后，呈剂量依赖性地削弱两种细胞的克隆形成(p＜0.001),且MI-503在1μM时完全阻止两种细胞形成克隆。 (4)CETSA实验表明MI-503与Menin蛋白在143B细胞中相互结合，且结合情况呈剂量依赖性（p＜0.01)。 (5)Western blotting结果表明，不同浓度MI-503处理143B细胞48h后，以剂量依赖的方式抑制H3K4me3,同样的处理也显著抑制H3K4me1和H3K4me2。 (6)1μM的MI-503作用于143B细胞24h,48h,72h后，RT-qPCR结果显示MI-503处理后显著抑制143B细胞c-Myc和Mcl-1的mRNA表达(p＜0.01)。 (7)Western blotting结果显示，不同浓度MI-503作用于143B和Saos-2细胞72h,两种细胞均出现c-Myc和Mcl-1蛋白表达水平的下降，p27蛋白表达水平升高，且呈剂量依赖性。cl-PARP蛋白在较低MI-503浓度刺激下无明显表达，而较高MI-503浓度刺激其表达。 (8)MI-503治疗骨肉瘤模型小鼠可显著抑制肿瘤生长。免疫组织化学结果显示，H3K4me3和Ki67的表达在治疗组中明显低于对照组（p＜0.001）。 结论： （1）人骨肉瘤癌组织中H3K4me3的表达高于癌旁组织。 （2）MI-503在体外细胞实验中显示出抗骨肉瘤作用，且抗骨肉瘤作用在一定范围内表现出剂量依赖性。 （3）MI-503与Menin蛋白在143B细胞中相互结合，且结合呈剂量依赖性。 （4）MI-503在骨肉瘤小鼠模型体内显示出强大抗骨肉瘤作用。 （5）MI-503抗骨肉瘤机制为MI-503靶向MLL1-Menin之间的相互作用抑制H3K4甲基化，最终导致c-Myc,Mcl-1,Ki67的表达抑制和P27,cl-PARP的表达上调。这些变化与细胞增殖、分裂或细胞凋亡密切相关，从而达到抑制骨肉瘤进展的作用。
NETL