摘要
背景与目的： 牙本质发育不良Ⅰ型(dentin dysplasia type Ⅰ,DD-Ⅰ）是一种罕见的以牙根发育畸形或缺如、牙本质矿化异常为主要特征的口腔遗传性硬组织疾病，可累及乳牙和恒牙列。患牙常表现为尖锥状短根，在青少年时期即可发生移位甚至自发脱落，罹患牙牙冠形态正常，主要依靠影像学检查发现牙根形态异常进行初步诊断。本课题组前期收集到一个32人(患者共12人)的大家系，经过影像学检查初步诊断为DD-Ⅰ;利用经典连锁分析、全基因组测序及Sanger测序等方法筛查到该家系的突变基因为VPS4B。液泡分选蛋白4B(vacuolar protein sorting 4B,VPS4B)在小鼠体内广泛分布，并在小鼠牙胚发育过程中呈时空特异性表达,对牙齿的形成至关重要。小鼠臼齿的结构和发育过程与人类相似，且具有生长繁殖周期短、遗传背景易于控制等优点，可通过遗传改造构建具有特定基因突变的小鼠模型来研究特定的牙体组织相关遗传病。目前与牙本质发育异常疾病相关的动物模型多数已建立。本课题组前期通过CRISPR-Cas9技术构建的Vps4b全基因敲除(knockout,KO)小鼠模型因胚胎期致死未获得纯和子，因此类DD-Ⅰ表型的动物模型建立仍是一个亟待解决的实验难题。Cre-Loxp系统由Cre重组酶和Loxp位点两部分组成，可以利用组织特异性启动子控制Cre在特定组织表达，实现在特定组织细胞中对目的基因进行敲除或改造;角蛋白14(keratin 14,K14)在牙源性上皮细胞中表达，常用来追踪上皮根鞘断裂后的分解与转归。本实验基于Cre-Loxp系统，由K14-Cre介导，繁育获得Vps4b基因牙源性上皮条件性敲除小鼠，旨在建立一种Vps4b上皮特异性表达的动物模型，重现DD-Ⅰ患牙表型，并通过多种方法分析其臼齿的形态结构，为进一步研究DD-Ⅰ分子致病机制提供有力的支持。 方法： 1.通过Cre-Loxp系统构建Vps4b基因条件性敲除小鼠模型，运用PCR技术初步鉴定幼鼠基因型; 2.通过体式显微镜观察不同基因型小鼠的离体牙及下颌骨，比较其外形及臼齿磨耗程度;通过高分辨全景X射线观察尾锥骨、头骨、四肢骨、肋骨的形态及密度; 3.通过Micro-CT定量分析不同基因型小鼠牙齿、髓腔及牙槽骨的体积与牙齿、牙槽骨的密度; 4.通过扫描电镜比较不同基因型小鼠牙本质小管的数目及排列方式，通过EDS能谱仪分析牙本质的元素种类与含量; 5.制备臼齿石蜡切片，通过苏木精-伊红染色法，观察不同基因型小鼠前期牙本质层的厚度、髓腔形态和细胞排列情况; 6.制备臼齿石蜡切片，通过免疫组织化学染色法，分析不同基因型小鼠臼齿中VPS4B、DSPP及Biglycan的表达水平。 结果： 1.Vps4bfl/fl:K14-Cre+基因型纯合子小鼠在胚胎期死亡，仅有Vps4bfl/+:K14-Cre+基因型杂合子(HET)小鼠存活。与对照组(Vps4bfl/fl,CG)相比，臼齿切片HET成牙本质细胞中VPS4B表达水平降低(P＜0.05),证明cKO杂合子小鼠Vps4b基因被部分敲除。 2.体式显微镜及高分辨全景X线未观察到HET小鼠牙齿外形、臼齿磨耗程度、下颌骨、尾锥骨、头骨、四肢骨和肋骨的形态及密度出现明显异常。 3.Micro-CT二维平面及三维重建图未观察到HET小鼠牙根、髓腔出现明显畸形、闭塞现象;Micro-CT分析显示两组小鼠第一、二臼齿髓腔及根周牙槽骨的体积与密度差异无统计学意义(P＞0.05);髓腔和牙体硬组织的体积比差异无统计学意义(P＞0.05)。 4.扫描电镜下未观察到HET小鼠牙本质小管的排列及疏密程度出现异常;EDS能谱分析显示HET小鼠牙本质的Ca和P元素质量比均低于CG小鼠。 5.苏木精-伊红染色未观察到HET小鼠成牙质及牙髓细胞的排列分布出现异常，HET小鼠前期牙本质相较CG小鼠有增宽。 6.免疫组化染色结果显示两组小鼠牙齿中DSPP表达水平差异无统计学意义(P＞0.05),HET小鼠中Biglycan表达水平增加(P＜0.05)。 结论： 1.Vps4b导致条件性基因敲除小鼠纯合子胚胎致死,其是小鼠发育过程中的关键基因;Vps4bfl/+:K14-Cre+条件性敲除小鼠动物模型未检测到类似DD-Ⅰ患牙的典型表型，也未检测到牙槽骨、骨骼形态发生显著变化; 2.Vps4bfl/+:K14-Cre+条件性敲除小鼠的前期牙本质增宽，同时Ca、P元素质量百分比降低，Biglycan的表达水平增高;提示Vps4b条件性基因敲除小鼠牙齿的牙本质矿化能力可能有所降低。
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