摘要
背景和目的: 肺癌是一种常见的恶性肿瘤，发病位置为患者肺部，其死亡率居世界前列。根据病理学的不同，临床上肺癌主要分为小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)和非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC);非小细胞肺癌又可以分为肺腺癌(lung adenocarcinoma,LUAD)、肺鳞癌(lung squamous carcinoma,LUSC)和大细胞肺癌(Large cell lung cancer,LCC)等。虽然我们在肺癌的诊疗方面做出了很大努力，但是由于早期诊断率不高导致大量患者就诊时已是中晚期，且部分肺癌患者出现了远处转移或者器官衰竭，从而表现出更差的预后和更低的生存率。目前尽管已经开展了许多临床研究以达到早期诊断和早期治疗的目的，但是并未取得理想的结果。因此我们仍需要继续寻找新的治疗靶点来取得进一步的突破。 Ikaros 锌指家族转录因子(Ikaros zing finger family transcription factors)已被证明在淋巴细胞生成和骨髓瘤进展中起重要的作用，但它们在实体瘤发展中的作用尚不清楚。IKZF4是其家族的一员，通过生物信息学分析,研究发现IKZF4在不同类型的肿瘤中均异常表达，因此在肺癌中IKZF4是一个值得研究的目标,有望为肺癌的治疗提供新的思路。 方法: 1.采用生物信息学分析癌症和肿瘤基因图谱(TCGA),以确定IKZF家族成员在多个肿瘤组织中表达紊乱及预后情况，研究IKZF家族成员在非小细胞肺癌肿瘤中的表达量和预后的相关性，同时构建IKZF家族成员在非小细胞肺癌的预后模型。 2.采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、蛋白质印迹方法检测IKZF4在非小细胞肺癌细胞系和正常肺泡支气管上皮细胞Beas-2B的表达差异。甲基化数据库对IKZF4的启动子甲基化状态进行探索并加以实验证明。 3.在非小细胞肺癌细胞系中构建IKZF4过表达细胞系和对照细胞系，HEK-293T细胞转染之后收集慢病毒来感染野生型肺癌细胞系H1975和SPC-A1,建立H1975和SPC-A1过表达细胞系，同时利用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹实验进行检测。 4.使用H1975和SPC-A1过表达细胞系，利用生长曲线实验、5-溴脱氧尿苷(BrdU)掺入实验、集落形成实验、流式细胞术、细胞划痕实验、Trans-well实验和蛋白质印迹测定确定IKZF4在体外非小细胞肺癌细胞生长和迁移中的功能。利用流式细胞术检测IKZF4对细胞周期的影响，同时检测周期蛋白相关标志物的变化。 5.使用IKZF4过表达细胞系和对照细胞系进行裸鼠皮下异种移植肿瘤形成，观察成瘤情况，如肿瘤形成时间、肿瘤重量、肿瘤体积。并通过免疫组化IHC测定，研究移植瘤的IKZF4蛋白、相关增殖蛋白Ki-67以及相关凋亡蛋白Cleaved Caspase 3的表达水平，以验证IKZF4在体内的作用。 6.采用生物信息学分析推断IKZF4可能影响EMT的过程，应用免疫荧光测定法检测IKZF4的亚细胞位置，用RNA-seq分析、GO和KEGG富集分析挖掘IKZF4调控非小细胞肺癌的分子机制，并加以实验验证。 7.利用网络数据库研究IKZF4的表达与肺癌肿瘤微环境的关系，与免疫浸润和免疫检查点抑制剂之间的联系。 8.使用组织微阵列(TMA)及非小细胞肺癌患者临床样本进行IKZF4表达量的检测。同时利用网络数据库筛选出潜在的IKZF4激动剂药物。 结果: 1.生物信息学研究发现IKZFs在多个肿瘤组织中表达失调且与临床预后相关，IKZF4在非小细胞肺癌中显著低表达并且与临床指标相关，IKZF4表达低与患者临床结局不佳明显相关，低表达导致患者预后更差。 2.IKZF4在非小细胞肺癌组织和细胞系中由于启动子高甲基化而表达量显著降低。 3.过表达IKZF4显著抑制非小细胞肺癌细胞生长、迁移，表明IKZF4在非小细胞肺癌肿瘤恶性进程中的抑制作用，同时使细胞周期阻滞在G2/M期。动物实验证明了IKZF4过表达抑制异种移植肿瘤生长,且IKZF4蛋白和凋亡蛋白表达增多，相关增殖蛋白表达受到抑制。 4.在机制上，IKZF4过表达可以抑制了非小细胞肺癌细胞系EMT的过程。免疫荧光染色显示IKZF4位于SPC-A1和H1975的细胞核中，同时RNA-seq结果表明，过表达IKZF4显著抑制了非小细胞肺癌中的Notch信号通路。 5.非小细胞肺癌中IKZF4表达与多种免疫细胞(B细胞、CD4+T细胞、中性粒细胞和树突状细胞)浸润水平呈正相关，且与免疫检查点抑制剂临床反应性相关，提示IKZF4可能与肿瘤免疫之间存在潜在的关系。 6.组织微阵列(TMA)及非小细胞肺癌患者临床样本中检测IKZF4在肿瘤组织中表达量低，且IKZF4低表达的患者预后情况更差。 结论: 数据表明IKZF4在非小细胞肺癌中的癌与癌旁组织有差异性表达，在肿瘤组织中IKZF4是低表达，同时低表达的IKZF4与患者预后呈现正相关。体内外实验证明IKZF4在非小细胞肺癌中起肿瘤抑制因子的作用，因此IKZF4在未来可能被作为潜在的治疗靶点。
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