摘要
不孕症影响全世界8％-12％的夫妇，而年龄是影响女性生育力的独立危险因素，现普遍认为女性卵巢功能在35岁时开始急速减退。随着女性生育年龄的推迟以及国家政策的放开，高龄生育者越来越多。目前尚无改善高龄女性卵巢功能和提高其生育力的有效措施，即使采用辅助生殖技术(assisted reproductive technology,ART)助孕，高龄也会不可避免地影响其成功率。研究表明，随着年龄的增加，女性卵巢储备功能下降，对外源性促性腺激素的反应性降低，卵母细胞质量减退，胚胎非整倍体率上升，导致活产率降低，流产率升高。卵子质量是决定妊娠成功与否的关键因素，而卵子的生长发育离不开其周围卵泡液(follicle fluid,FF)及颗粒细胞(granulosa cell,GC)的支持作用。颗粒细胞与卵子进行双向通讯，确保卵子的正常发育成熟。卵子被卵泡液包围，其内包含多种活性分子,为卵子的发育提供一种特殊的微环境。鉴于卵巢中颗粒细胞及卵泡液在卵子的发育成熟过程中至关重要，因此二者的代谢状态能在一定程度上反映卵子及胚胎的质量，从而预测可能的妊娠结局。代谢组学(metabolomics)是近年来新兴的一种技术，能够检测机体内代谢物的变化，进而揭示生理或病理变化的可能机制。鉴于代谢组学具有高分辨率、高敏感性及高通量等优点，现已广泛应用于多种学科，但目前鲜有研究基于代谢组学技术，探究高龄对女性颗粒细胞及卵泡液代谢谱的影响。 目的： 分析不同年龄段不孕女性ART助孕结局的差异，并利用代谢组学方法探究高龄女性颗粒细胞及卵泡液中的代谢变化，从而寻找卵巢衰老相关代谢通路和差异代谢物，并分析差异代谢物与临床结局指标的相关性，为改善高龄女性卵巢功能，提高其生育力提供理论依据。 方法： 收集我中心因输卵管因素或男方因素不孕的不同年龄段女性病人45例，根据年龄不同分为三组:A组(20岁≤年龄＜30岁)、B组(30岁≤年龄＜35岁)和C组(35岁≤年龄＜45岁)，每组各15例。 1.所有病人均采用卵泡期长效长方案进行控制性卵巢刺激，收集病人的基线资料、促排资料和临床结局资料，统计分析三组病人的基线资料和临床结局的差异。 2.于取卵日当天收集病人的卵泡液及颗粒细胞，采用液相色谱-串联质谱法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)对三组病人的颗粒细胞及卵泡液进行代谢组学分析，筛选差异代谢物并将其进行代谢通路富集分析和受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC) 曲线分析。 3.采用Pearson相关性分析，分析颗粒细胞和卵泡液中的差异代谢物与临床结局指标的相关性。 结果： 1.基线资料和临床结局资料比较结果显示，三组病人的基础卵泡刺激素(follicle stimulating hormone,FSH)和抗苗勒管激素(anti-Mullerian hormone,AMH)水平未见明显统计学差异(P＞0.05)。然而，获卵数(15.53±6.28 vs.10.33±5.01,P=0.011)、分裂中期(metaphase Ⅱ,MⅡ)卵子数(13.40±4.97 vs.8.93±4.57,P=0.011)、双原核(two pronuclei,2PN)受精数(9.80±3.05 vs.6.33±3.83,P=0.014)和可移植胚胎数(6.20±2.46 vs.3.87±2.39，P=0.013)在A、C两组间差异显著。新鲜周期移植率及移植后的生化妊娠率、临床妊娠率、活产率和流产率在三组间未见统计学差异(P＞0.05)。 2.主成分分析(principal component analysis,PCA)结果显示，颗粒细胞的代谢成分在三组间无法完全区分，而卵泡液的代谢成分在A、C组间差异显著，因此，后续主要探究A组(20岁≤年龄＜30岁)和C组(35岁≤年龄＜45岁)的代谢组学差异。偏最小二乘法-判别分析(partial least squares-discriminate analysis,PLS-DA)结果显示，A组和C组的颗粒细胞和卵泡液代谢数据组内聚集和组间分离趋势显著。 3.在A组和C组病人的颗粒细胞中共筛选出21种差异代谢物，其中11种代谢物于C组下调，10种代谢物上调。在两组病人的卵泡液中共筛选出72种差异代谢物，其中37种代谢物于C组上调，35种代谢物下调。对差异代谢物进行代谢通路富集分析，卵泡液和颗粒细胞的差异代谢物分别富集到35和18条代谢通路(P＜0.1),包括过氧化物酶增殖物激活受体(peroxidase proliferator activator receptor,PPAR)信号通路(PPAR signaling pathway)、环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)信号通路(cAMP signaling pathway)及半胱氨酸和蛋氨酸代谢(cysteine and methionine metabolism)等。二者共同富集到6条代谢通路，分别是蛋白质的消化和吸收(proteindigestion and absorption)、ABC转运体(ABC transporters)、γ-氨基丁酸(Gamma-Aminobutyric acid,GABA)能突触(GABAergic synapse)、吗啡成瘾(morphine addiction)、突触囊泡循环(synaptic vesicle cycle)及半胱氨酸和蛋氨酸代谢。颗粒细胞和卵泡液中并无相同的差异代谢物，进一步分析结果显示颗粒细胞的差异代谢物GABA和卵泡液的差异代谢物琥珀酸(succinic acid)均映射至GABA能突触通路上，且二者为上下游关系。对GABA和琥珀酸进行ROC曲线分析，结果表明二者的曲线下面积分别为0.827和0.716。 4.相关性分析结果显示，颗粒细胞的差异代谢物中，GABA与获卵数、MⅡ卵子数和2PN受精数呈显著正相关(R＞0.5,P＜0.01),谷胱甘肽(glutathione)与可移植胚胎数和优质胚胎数呈显著正相关(R＞0.5,P＜0.01)。卵泡液的差异代谢物中，肉豆蔻酸(myristic acid)与获卵数、MⅡ卵子数和2PN受精数呈显著正相关(R＞0.5,P＜0.01),而去甲肾上腺素(norepinephrine)与获卵数和MⅡ卵子数则呈显著负相关(R＜-0.5,P＜0.01)。 结论: 1.高龄女性与年轻女性的颗粒细胞和卵泡液代谢谱差异显著，PPAR信号通路、cAMP信号通路及半胱氨酸和蛋氨酸代谢等多条代谢通路可能与卵巢衰老过程相关。 2.GABA和琥珀酸分别在高龄女性的颗粒细胞和卵泡液中显著下调，其可能作为改善卵巢衰老的潜在治疗靶点。 3.颗粒细胞和卵泡液中的多种差异代谢物与ART周期结局具有显著相关性,GABA与获卵数、MⅡ卵子数及2PN受精数均呈显著正相关;谷胱甘肽与可移植胚胎数及优质胚胎数呈显著正相关;去甲肾上腺素与获卵数及MⅡ卵子数呈显著负相关。
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