摘要
背景和目的： 糖尿病神经系统并发症是糖尿病常见的并发症之一。糖尿病认知功能障碍（Diabetic cognitive dysfunction，DCD）是指由糖尿病引起的认知功能损伤，临床主要表现为学习能力、记忆能力、语言表达能力及判断能力下降。目前尚无有效治疗DCD的药物，临床上除了控制血糖外，常推荐补充叶酸和维生素B12（Vitamin B12， VB12）来防治DCD。但研究发现，补充叶酸和VB12只能预防和改善部分DCD患者。此外，不同人群的随机对照试验表明，二十二碳六烯酸（Docosahexaenoic acid，DHA）与叶酸和VB12在防治认知功能障碍方面具有协同效应，但机制尚不明确。 基于此，本研究的目的是研究糖尿病患者体内DHA与叶酸和VB12状态与DCD的关系（第一章）；通过建立糖尿病小鼠模型，用富含DHA的深海鱼油和（或）叶酸和VB12联合干预，探究DHA与叶酸和VB12联合补充预防DCD的效果及分子机制。 方法： 第一章横断面研究。在青岛胶州市里岔镇10个自然村中纳入所有65岁以上糖尿病患者。通过问卷调查收集志愿者的一般人口学特征，采用简易智能精神状态检查量表（Mini-mental State Examination，MMSE）评估志愿者的认知功能，同时采集志愿者外周血，检测空腹血糖、血脂四项、同型半胱氨酸（Homocysteine，HCY）等血清生化指标，通过气相色谱法检测红细胞膜脂肪酸成分。采用多因素logistic 回归分析红细胞膜DHA、血清HCY与DCD的相关性，通过绘制受试者工作特征曲线（Receiver operator characteristic curve，ROC）计算曲线下面积，初步评估 DHA联合HCY对DCD的预测价值。 第二章动物实验。首先采用链脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）构建8周龄雄性C57BL/6J小鼠糖尿病模型，根据体重将其随机分为糖尿病模型组（DM）、二甲双胍组（MET，150 mg/kg）、深海鱼油组（DHA，150 mg/kg）、叶酸和VB12组（VB，叶酸100 μg/kg和VB12 65 μg/kg）、鱼油联合叶酸和VB12组（DHA+VB，鱼油150 mg/kg+叶酸100 μg/kg和VB12 65 μg/kg），同时设置正常对照组（NC）。通过灌胃干预，连续干预 12 周后，进行小鼠行为学测试，包括新物体识别、Y 迷宫和 Morris水迷宫。行为学测试结束后，小鼠正常饲养5天，随后处死，收集小鼠血清和脑组织等样品。检测血清生化指标、脑组织脂肪酸成分、脑组织病理、脑组织 DNA 表观遗传修饰及相关催化酶、甲基供体、脑组织三羧酸循环代谢产物及相关蛋白酶等。 结果： 横断面研究共纳入老年糖尿病患者287人，根据受教育程度和MMSE得分，共发现DCD患者99例，患病率为34.5%。DCD组红细胞膜DHA水平显著低于糖尿病组（Diabetes mellitus, DM）（P＝0.013）。DCD组HCY平均水平（11.50 μmol/L）高于DM组（10.61 μmol/L），但两组间差异尚不具备统计学意义。在调整了年龄、性别、婚姻状况、居住状况、教育程度、吸烟、饮酒、身体质量指数（Body mass index， BMI）、高血压病史等可能的混杂因素后，DHA T3分位的DCD风险相对于T1分位降低约53%（OR＝0.427，95%CI：0.223，0.818），HCY T2分位的DCD风险约是T1分位的2.2倍（OR＝2.175，95%CI：1.126，4.199）。ROC曲线显示，相对于单独纳入DHA（AUC＝0.705，95% CI：0.642，0.768；灵敏度：0.796，特异度：0.516；Youden指数：0.312）或单独纳入HCY（AUC＝0.696，95% CI：0.631，0.761；灵敏度：0.582，特异度：0.750；Youden指数：0.322），同时纳入DHA和HCY建模能更好地预测DCD风险（AUC＝0.722，95% CI：0.659，0.786；灵敏度：0.653，特异度：0.745；Youden指数：0.398）。 动物实验结果如下： （1）在Y迷宫实验中，DM组的自主交替百分比和识别记忆指数显著低于NC组，DHA 组和 VB 组的自主交替百分比和识别记忆指数与 DM 组无显著差异，而DHA+VB组的自主交替百分比和识别记忆指数显著高于DM组。在水迷宫实验中， DM 组的逃避潜伏期显著高于 NC 组，平台穿越次数和目标象限停留时间显著低于NC组，DHA组和VB组的逃避潜伏期、平台穿越次数和目标象限停留时间与DM组无显著差异，而DHA+VB组的的逃避潜伏期显著低于DM组和DHA组，平台穿越次数和目标象限停留时间显著高于DM组； （2）DM组的空腹胰岛素和HOMA-IR显著高于NC组，DHA组的空腹胰岛素和HOMA-IR与DM组无显著差异，而VB组和DHA+VB组的HOMA-IR显著低于DM组。DM组的TC、TG、HDL-C及LDL-C水平显著高于NC组，DHA组和VB组的TG、LDL-C水平显著低于DM组；而DHA+VB组的TC、TG、HDL-C及LDL-C水平均显著低于DM组； （3）DHA组、VB组和DHA+VB组的脑组织DHA水平显著高于DM组，且DHA+VB组的脑组织DHA水平显著高于DHA组和VB组。DM组的血清HCY水平显著高于NC组，DHA组、VB组和DHA+VB组的HCY水平显著低于DM组； （4）DM组的神经元凋亡率显著高于NC组，DHA组、VB组和DHA+VB组的神经元凋亡率显著低于DM组。DHA组和VB组的神经元标志蛋白NeuN表达与DM组无显著差异，而DHA+VB组的NeuN蛋白表达显著高于DM组。DM组、DHA组和VB组的抑凋亡蛋白Bcl-XL显著低于NC组，而DHA+VB组的Bcl-XL表达与NC组相当。DM组的促凋亡蛋白Bax表达显著高于NC组，DHA组和VB组的Bax蛋白表达与DM组无显著差异，而DHA+VB组的Bax蛋白表达显著低于DM组； （5）各组间DNA 5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，5mC）总体水平无显著差异，而VB组的5mC总体水平数值上高于其余各组。DM组的大脑基因组DNA 5-羟甲基胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine，5hmC，DNA去甲基化主要产物）总体水平显著低于NC组，DHA组、VB组和DHA+VB组的5hmC总体水平显著高于DM组，且DHA组的5hmC总体水平数值上高于其余各组。DM组的5mC/5hmC比值显著高于NC组，DHA组、VB组和DHA+VB组的5mC/5hmC比值显著低于DM组，而与NC组相当，且DHA+VB组的5mC/5hmC比值与NC组最为接近。各组间DNA甲基转移酶（DNA methyltransferases，DNMTs）家族的蛋白表达无显著差异。VB组的S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine，SAM）浓度显著高于NC组、DM组、DHA组及DHA+VB组，VB组和DHA+VB组的S-腺苷同型半胱氨酸（S-adenosine homocysteine，SAH）浓度显著低于 DM 组，且 VB 组的SAH浓度显著低于 DHA组，VB组的SAM/SAH比值显著高于NC组。DM组的10-11转位蛋白酶2（Ten-eleven translocation proteins 2，TET2）蛋白表达显著低于NC组，DHA组和VB组的TET2蛋白表达相对于DM组呈上升趋势，但差异无统计学意义，DHA+VB组TET2蛋白表达显著高于DM组； （6）DM组的α-酮戊二酸（α-ketoglutaric acid，α-KG）水平显著低于NC组， DHA组、VB组和DHA+VB组的α-KG水平显著高于DM组。DM组的α-KG/（琥珀酸+延胡索酸）比值显著低于NC组，DHA组、VB组和DHA+VB组的α-KG/（琥珀酸+延胡索酸）比值显著高于DM组； （7）DM组的p-AMPK/AMPK比值显著低于NC组，而DHA组和DHA+VB组的p-AMPK/AMPK比值显著高于DM组，VB组的p-AMPK/AMPK比值相对于DM组呈上升趋势但差异无统计学意义。 结论： （1）较高红细胞膜DHA水平的糖尿病患者合并DCD的风险较低，较高血清HCY浓度的糖尿病患者合并DCD的风险较高；且红细胞膜DHA联合血清HCY建模能更好地预测DCD的风险。 （2）叶酸和VB12通过增加甲基供体而促进DNA甲基化；DHA通过增强三羧酸循环稳态促进TET酶活性，通过激活p-AMPK增强TET2蛋白稳定性，进而促进DNA去甲基化；叶酸和VB12与DHA联合补充共同维持DNA甲基化与去甲基化平衡，从而预防DCD的发生。
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