摘要
目的： 1.用TNFα诱导MH7A细胞、用LPS诱导RAW264.7细胞，复制两种炎症模型，探讨异绿原酸A（ICA）的抗炎作用；用RANKL和M-CSF诱导RAW264.7为破骨细胞，研究ICA抑制骨吸收的作用。 2.阐明ICA在体外抗炎和抑制骨吸收的作用机制。 方法： 1.CCK8法检测ICA对MH7A和RAW264.7细胞活力的影响。 2.用RANKL和M-CSF诱导RAW264.7，产生破骨细胞，与ICA共孵育，TRAP染色和SEM检测ICA对破骨细胞的形成和骨吸收功能的影响，Western blot检测破骨相关蛋白TRAP和CTSK的表达。 3.用TNFα处理MH7A细胞，建立炎症损伤模型，与ICA共孵育，qRT-PCR检测ICA对炎症因子IL-17A、IL-17F、IL-1β和IL-23和通路蛋白ERK、JNK、P38和STAT3表达的影响；Western blot检测ICA对炎症因子IL-17A、IL-17F、IL-1β和IL-23的表达和通路蛋白ERK、JNK和P38的磷酸化和非磷酸化表达的影响。 4.用LPS处理RAW264.7细胞，建立炎症损伤模型，qRT-PCR检测ICA对IL-6、TRAP、MMP9、STAT3、ERK和JNK表达的影响；Western blot检测ICA对表型因子IL-17A、TRAP和TRAF6的表达和通路蛋白STAT3、ERK、JNK和P38的磷酸化和非磷酸化表达的影响。 5.利用RNA-Seq方法，通过差异基因定量图分析各组之间差异基因的整体变化；查阅文献，筛选与本课题相关且有研究前景的基因；KEGG-Pathway分析组间细胞的通路活跃情况，并采用qRT-PCR进行验证。 结果： 1.HPLC检测结果表明，蒙药塔布森-2（Tubson-2，TBD）的两味药中均含有ICA。 2.CCK-8检测细胞活力的结果表明，在24小时内，ICA作用于MH7A和RAW264.7细胞的最大安全浓度均是400μM，作用浓度分别是20μM和1μM、20μM、50μM。 3.ICA对MH7A细胞炎症损伤模型的干预结果表明，TNFα（50ng/mL）处理MH7A细胞，复制炎症损伤模型，用ICA（20μM）干预，qRT-PCR和/或Western blot的结果均表明，ICA可不同程度地逆转TNFα引起炎症因子MMP13、IL-1β、IL-17A、IL-17F、IL-23以及STAT3与MAPK通路的关键分子ERK、JNK和P38的升高。 4.ICA对RANKL和M-CSF诱导的破骨细胞的作用结果表明，RANKL（100ng/mL）和M-CSF（30ng/mL）处理RAW264.7细胞，诱导出成熟的破骨细胞，分别与不同浓度的ICA（1μM、20μM、50μM）共孵育。 结果表明，ICA可不同程度地抑制破骨细胞的形成，且对破骨细胞的数量、大小、周长均有抑制作用，呈浓度依赖性；不同浓度的ICA可抑制小牛骨切片上出现的骨吸收陷窝，且吸收坑的数量和面积百分比与ICA的浓度呈负相关；ICA可不同程度地下调破骨细胞诱导过程中标志酶蛋白TRAP和CTSK的表达。 5.ICA对RAW264.7细胞炎症损伤模型的干预结果表明，LPS（1mg/mL）处理RAW264.7细胞，复制炎症损伤模型，分别与不同浓度的ICA（1μM、20μM、50μM）共孵育。qRT-PCR结果表明，ICA可不同程度地对抗LPS引发的IL-6、TRAP、MMP9以及STAT3与MAPK通路的关键分子ERK、JNK和P38的升高。 8.采用真核转录组测序技术探索ICA发挥抗炎作用的其他机制。给药组（TNFα+ICA）和模型组（TNFα）之间的差异基因结果表明，三个上调，两个下调，其中，LY75具有较高的研究意义；信号通路的KEGG富集分析结果表明，Toll-like receptor signaling pathway处于相对活跃状态。TNFα（50ng/mL）处理MH7A细胞，与ICA（20μM）共孵育，qRT-PCR检测LY75和Toll样信号通路关键蛋白。 结果表明，ICA可不同程度地下调TNFα引起的LY75、TLR4、TLR9和MYD88的升高。 结论： 1.ICA可以对抗MH7A细胞和RAW264.7细胞的炎症反应，并抑制RAW264.7的破骨分化和骨吸收功能。 2.ICA体外抑制炎症和骨吸收的分子机制可能与其下调IL-17/STAT3/MAPK通路和Toll样受体信号通路有关。
NETL