摘要
面对二十一世纪世界人口的迅速增长，急需提高全球农业生产能力，但过度使用化肥导致的危害又会严重影响人类生存环境，导致土壤退化、沙化、水源污染等问题。利用植物根际促生细菌（Plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）生产的微生物肥料作为化肥的替代品，对环境更加友好，潜力巨大。然而，PGPR生产的微生物肥料存在着大田使用效果不稳定等问题，提高微生物肥料使用效果的稳定性是非常重要的问题。PGPR根际趋化竞争力与其促生效果密切相关。本课题围绕提高PGPR根际趋化竞争力，以典型的PGPR菌株假单胞菌UW4（Pseudomonas sp. UW4）为实验材料，从三个方面进行了研究，主要结果如下。 1、使用分子对接技术鉴定出假单胞菌UW4趋化定殖根际的强趋化物 鉴定PGPR趋化根际的强趋化物，是构建高效PGPR工程菌的基础。应用平板趋化法、毛细管趋化法和根际定殖法等，工作量巨大且不准确。本课题采用分子模拟对接技术，快速简便地筛选得到UW4趋化定殖根际的强趋化物。首先进行了UW4具胞外配体结合域的15个趋化受体（族I趋化受体）与常见的59种植物根系分泌物分子进行了分子模拟对接，计算出结合自由能。从根系分泌物中氨基酸类、有机酸类和糖类中各选取 6 种化合物，共 18 种化合物，采用毛细管法测定了UW4趋化这些化合物的阈浓度，发现该18种化合物与UW4族I趋化受体的最低结合自由能的绝对值与UW4毛细管趋化阈浓度值的对数呈显著的负相关（plt;0.0001）。其中，1-氨基环丙烷-1-羧酸（1-Aminocyclopropane-1-carboxylic acid，ACC）与趋化受体wp116的结合自由能是UW4所有族I趋化受体与59种植物根系分泌物分子结合自由能中最低的，毛细管趋化法测定UW4趋化ACC的阈浓度值也是最低的。以上结果表明应用分子模拟对接可以替代趋化实验，快速地鉴定出PGPR趋化根际的强趋化物，假单胞菌UW4趋化根际的强趋化物是ACC。 2、假单胞菌UW4趋化定殖根际的强趋化物的受体C端嫁接五肽创制高效促生工程菌 绝大多数的PGPR菌中，至少有1个趋化受体的C-端带有一个能够和参与趋化的甲基转移酶CheR和甲基酯酶CheB结合的五肽，介导趋化受体的甲基化修饰，进而影响细菌对趋化物的趋化响应。为提高假单胞菌UW4趋化根际竞争力，本课题探讨了在UW4 ACC趋化受体的C-端嫁接五肽以提高其对ACC的趋化响应和根际趋化竞争力。首先，对假单胞菌UW4基因组中注释的28种趋化受体的C-端氨基酸序列进行比对分析，预测发现3种趋化受体末端可能存在有五肽。之后通过分子模拟对接和体外甲基化反应发现，只有趋化受体wp502的C-端五肽（PEKPR）能够与参与趋化的CheR2结合，并能介导wp502的甲基化。该五肽与其他细菌的五肽无序列保守性。将该五肽嫁接到UW4的ACC趋化受体wp116的C-端，构建工程菌UW4-1。将UW4-1的趋化受体wp502的C-端五肽截去，构建了工程菌UW4-2。 平板趋化结果，UW4-1对ACC的趋化响应分别比UW4和UW4-2提高36.0%和17.2%，但对精氨酸和琥珀酸趋化响应，该3个菌株没有差异。无菌瓶栽小麦接种该3个菌株，UW4-1在小麦根际的定殖量分别比UW4和UW4-2提高93.2%和37.1%。盆栽小麦接种该3个菌株，UW4-1在小麦根际的定殖量分别比UW4和UW4-2提高62.0%和14.3%。接种UW4-1小麦根长分别比接种UW4和UW4-2提高6.3%和4.3%，根干重分别提高10.3%和5.5%，小麦地上部高度分别提高16.0%和5.1%，小麦地上部干重分别提高16.5%和13.2%。以上结果表明，将五肽嫁接到PGPR趋化根际的强趋化物的趋化受体的C-端，能够显著提高PGPR对该强趋化物的趋化响应和根际趋化竞争力，促进作物的生长。 3、PGPR高效基因编辑系统的创建 相较于其他基因工程技术，基因编辑技术能够更高效地对PGPR菌株进行基因操作。然而，基因编辑技术在 PGPR 中的应用的第一个挑战即是要确保工程菌细胞在 CRISPR/Cas 诱导的双链DNA断裂（double-strand break，DSB）情况下存活。本课题组前期发现大肠杆菌的DNA单链结合蛋白（Single-stranded DNA-binding proteins，SSB），能够催化DNA的同源重组和非同源重组，且蛋白相对较小，易于操作，为探讨其在基因编辑中的应用，本研究将pCas/pTargetF中的λ-Red同源重组酶系敲除或替换为SSB和T4 DNA连接酶，构建了pCasΔRed/pTargetF、pCas-SSB/pTargetF和pCas-T4L/pTargetF基因编辑系统。 为分析SSB对CRISPR/Cas同源重组基因编辑的影响，将pCas/pTargetF-lacZ + donor DNA、pCasΔRed+pTargetF-lacZ+donor DNA、pCas-SSB+pTargetF-lacZ+donor DNA分别转化大肠杆菌MG1655，通过同源重组编辑大肠杆菌lacZ基因。转化pCasΔRed+pTargetF-lacZ+donor DNA的平板中，没有长出菌落。转化pCas+pTargetF-lacZ+donor DNA的平板和转化pCas-SSB+pTargetF-lacZ+donor DNA的平板中长出有蓝色菌落和白色菌落（lacZ基因发生了突变），基因编辑效率分别为73.4%和89.1%，pCas-SSB比pCas提高21.4%。将pCas-SSB+pTargetF-wp116+donor DNA转化假单胞菌UW4，通过同源重组编辑UW4的wp116基因，基因编辑效率为100%，突变株几乎丧失了对ACC的趋化响应。 为分析SSB对CRISPR/Cas非同源重组基因编辑的影响，将pCas-SSB/pTargetF-lacZ和pCas-T4L/pTargetF-lacZ分别转化大肠杆菌MG1655，通过非同源重组编辑 lacZ基因，基因编辑效率分别为86.3%和64.8%，pCas-SSB比pCas-T4L提高33.2%。 为分析SSB对CRISPR/Cas基因编辑的影响是否依赖RecA和RecBCD，将pCas/pTargetF-lacZ+donor DNA和将pCas/pTargetF-lacZ 分别转化大肠杆菌MG1655-2菌株（ΔrecAΔrecBCDΔSSB），通过同源重组和非同源重组编辑敲除lacZ基因，基因编辑效率分别为86.0%和87.6%。以上结果表明，SSB能够催化同源重组和非同源重组修复CRISPR/Cas诱导的DSB，提高基因编辑效率，pCas-SSB/pTargetF基因编辑系统可用于大肠杆菌和假单胞菌的高效基因编辑。 创新点： （1）建立了分子模拟对接法用于快捷鉴定PGPR趋化定殖根际的强趋化物； （2）发现了假单胞菌UW4菌株中一个新的五肽序列，并通过在UW4趋化定殖根际的强趋化物对应的趋化受体C端嫁接该五肽，创制了提高PGPR根际趋化竞争力和促生效果的工程菌； （3）创建的pCas-SSB/pTargetF基因编辑系统可对PGPR菌株进行更加高效的基因编辑。
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