摘要
肠道作为机体重要的消化器官和营养吸收部位，对于维持畜禽健康与生产性能发挥具有重要作用，但其容易受到多种致病因素影响从而引起肠道炎症，对畜禽生产危害较大。目前，治疗肠道炎症主要以抗生素、甾体和非甾体类药物为主，但过度地使用此类药物不仅会扰乱机体肠道菌群稳态，使肠道对病原体更加敏感，还会影响免疫细胞活性，降低治疗效果，同时还加剧了耐药性和药物残留问题，从而影响畜牧业发展，甚至造成环境污染。 地黄是我国传统中药，具有清热凉血、养阴生津等功效。鲜地黄中含有大量的低聚糖，具有抗炎、抗氧化、增殖益生菌等作用。本研究从地黄中提取分离地黄低聚糖（RGO），探讨RGO调节肠道菌群、保护肠道屏障从而减缓肠道炎症损伤的作用效果，以期为RGO在畜牧生产与兽医临床上的应用开发提供试验基础和理论依据。试验分为四部分： 第一部分：地黄低聚糖的提取方法研究 鲜地黄，洗净切块，加4倍量的水，100℃提取2次，每次提取时间为1 h，合并两次提取液，在提取液中加入活性炭和活性白土，80℃搅拌脱色30 min，离心，上清液分别依次经过001×7型阳离子交换树脂柱、D201型阴离子交换树脂柱、D101型大孔吸附树脂柱，上样量（mL）：树脂柱体积=1:1.5，流速为500 mL/h，最后，收集大孔吸附树脂流出液，在60 °C减压浓缩干燥，得到白色粉末，即为RGO。采用高效液相色谱仪检测RGO中低聚糖的种类和含量，结果表明：分离得到的RGO主要由水苏糖、棉子糖、毛蕊花糖组成，其相对含量分别为81.02%、5.19%、4.85%，低聚糖总量为91.06%。 第二部分：地黄低聚糖对6种益生菌体外增殖的影响 为了探讨RGO对益生菌的体外增殖作用，试验将嗜酸乳杆菌、发酵乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、动物双歧杆菌、长双歧杆菌婴儿亚种和短双歧杆菌6种益生菌分别以含4%、2%、1%、0.5%RGO为碳源的培养基培养，测定其促增殖能力、产酸情况、发酵液中短链脂肪酸生成情况与糖类成分的变化。结果表明：不同浓度RGO均可促进6种益生菌生长，其增殖能力与其浓度呈正相关，并且与葡萄糖相比，各菌种可优先利用RGO进行增殖。但RGO对6种益生菌的增殖能力不同，以对短双歧杆菌和罗伊氏乳杆菌增殖效果较好，优于同浓度葡萄糖培养基；发酵液中短链脂肪酸生成均以乙酸为主，但糖类成分的含量存在差异，短双歧杆菌和罗伊氏乳杆菌发酵液中主要为葡萄糖，而其他4种发酵液中除葡萄糖外还含有较多的棉籽糖、蔗糖。说明RGO可促进6种益生菌增殖，但增殖效果不同，其中短双歧杆菌和罗伊氏乳杆菌增殖效果最佳。 第三部分：LPS诱导小鼠肠道炎症和屏障损伤模型的建立 肠道是机体营养吸收的主要部位，也是LPS的靶器官之一。分别给KM小鼠腹腔注射不同剂量（1、2、4mg/kg）的LPS，连续干预三周，记录小鼠体重、粪便、健康状况。处死小鼠后，测量结肠长度、免疫器官指数。用苏木素-伊红（HE）染色观察回肠和结肠的形态变化，并测量绒毛长度、隐窝深度。ELISA法检测回肠和结肠组织中炎症因子（IL-6、TNF-α）和氧化指标（SOD、GSH-Px）的表达。结果显示，LPS浓度为1、2、4mg/kg时小鼠均表现行动迟缓，食欲不振，软便稀便，流泪，精神萎靡，被毛杂乱等症状，致炎后6 h症状最为明显。LPS组体重增长显著小于正常组，且LPS浓度越大差异越显著。LPS组结肠切片显示有部分绒毛上皮脱落和毛细血管淤血，肠道粘膜的完整性被破坏。LPS组回肠绒毛长度、结肠皱襞深度显著低于正常组，且绒隐比降低。综合考虑试验周期及成本，当腹腔注射1 mg/kg LPS连续三周可造成小鼠肠炎及屏障损伤模型。 第四部分：地黄低聚糖通过调节肠道菌群影响LPS诱导的小鼠肠道炎症和屏障损伤的研究 为探究RGO对LPS诱导的小鼠肠道炎症和屏障损伤的保护作用，对LPS诱导的肠道炎症和屏障损伤小鼠模型分别给予3个不同剂量的RGO，连续干预三周，记录小鼠体重、粪便、健康状况。处死小鼠后，测量结肠长度、免疫器官指数。HE染色观察回肠和结肠的形态变化，测量绒毛长度、隐窝深度。RT-qPCR检测肠道闭合小环蛋白1（ZO-1）和紧密连接蛋白（Occludin）的mRNA相对表达量。ELISA法检测回肠和结肠组织中炎症因子和氧化指标的表达，以及回肠内容物中消化酶的活性。GC法测定结肠内容物中短链脂肪酸（SCFAs）的含量。16S-rRNA高通量测序测定肠道微生物组成和多样性的变化。分析肠道微生物与SCFAs、紧密连接蛋白、消化酶、炎性因子含量和抗氧化指标之间的相关性。结果表明，与模型组比较，RGO能提高小鼠体重，提高小鼠胰腺指数、胸腺指数和结肠长度，改善肠道组织结构，提高肠道屏障相关连接蛋白ZO-1和Occludin的表达量。小鼠肠道组织中IL-6、IL-17、IL-1β、TNF-α含量显著降低（Plt;0.05），超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和过氧化氢酶(CAT)的活性升高，丙二醛（MDA）含量降低。回肠中胰蛋白酶、胰脂肪酶活性升高，结肠中乙酸、丙酸、丁酸等SCFAs的含量升高。肠道菌群研究表明，RGO能增加肠道菌群丰度，改善菌群结构，与模型组相比，RGO的摄入增加了小鼠肠道中乳杆菌及阿克曼菌的相对丰度，降低放线菌门的相对丰度，使肠道微生物结构向益生菌占主导地位转变。相关性分析表明，小鼠肠道中乳杆菌、阿克曼菌与SCFAs、Occludin、ZO-1、胰淀粉酶以及SOD、CAT活性呈正相关，与炎性因子IL-6、IL-17、IL-1β、TNF-α呈负相关。说明RGO能降低LPS所致的小鼠肠道炎症和肠道屏障损伤，保护小鼠肠道功能，并且RGO可能是通过调节肠道菌群发挥改善肠道炎症状态和维持肠道屏障的作用。
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