摘要
乳腺的泌乳量取决于泌乳细胞的数量和质量。在妊娠期及泌乳期的乳腺组织中存在乳腺前体脂肪细胞向乳腺上皮细胞转分化的现象，乳腺脂肪细胞转分化成乳腺上皮细胞的数量对乳腺泌乳量具有决定性作用。因此研究奶山羊妊娠及泌乳过程中乳腺脂肪细胞的转分化以及影响该过程的基因调控机制对提高奶畜泌乳量具有重要意义。本实验室前期成功诱导了体外培养的乳腺前体脂肪细胞向乳腺上皮细胞转分化，并通过分析转分化前后乳腺前体脂肪细胞的转录组差异，筛选到了调控转分化过程的关键基因RND1（Rho家族GTP酶1），及与其关联的转录因子CTCF。目前关于RND1影响奶山羊乳腺前体脂肪细胞转分化成乳腺上皮细胞的研究尚无报道。因此，本研究旨在探究RND1在奶山羊乳腺前体脂肪细胞诱导转分化为乳腺上皮细胞过程中的作用，为奶山羊妊娠期至泌乳期的乳腺发育调控机理相关研究提供基础资料。 本研究以奶山羊原代乳腺前体脂肪细胞、原代乳腺上皮细胞为试验材料，首先使用条件培养基诱导乳腺前体脂肪细胞向上皮细胞转分化，然后检测转分化前后乳腺前体脂肪细胞中RND1的表达量，并利用基因过表达、细胞蛋白质免疫印迹等技术探究RND1在乳腺前体脂肪细胞向上皮细胞转分化过程中的作用。获得主要结果如下： 1、使用培养乳腺上皮细胞的培养基上清与DMEM/F12以1:1混合制备条件培养基，诱导乳腺前体脂肪细胞向乳腺上皮细胞转分化。在诱导转分化的第10d，倒置荧光显微镜观察到乳腺前体脂肪细胞的形态由纺锤形变为上皮样细胞形态，同时前体脂肪细胞标志基因CD34、DLK1的mRNA及蛋白质的表达量下调（P＜0.01），上皮细胞标志基因CDH1（P＜0.05）及KRT18（P＜0.01）的mRNA及蛋白质的表达量上调。 2、克隆得到奶山羊RND1 CDS区，该基因全长699bp，编码232个氨基酸。奶山羊RND1蛋白在进化上与山羊、绵羊、牛、马鹿的遗传距离最小。对不同泌乳时期乳腺组织中RND1的mRNA表达量进行检测，发现RND1在奶山羊泌乳早期表达量最高。 3、构建奶山羊pcDNA3.1-RND1真核表达载体，在乳腺前体脂肪细胞中过表达RND1后，上调了上皮标志基因CDH1、ELF5的mRNA表达量（P＜0.01）及上皮极性相关基因SCRIB的mRNA表达量（P＜0.05），下调了脂滴生成相关基因FABP4的mRNA的表达量（P＜0.05）。在乳腺前体脂肪细胞中过表达RND1的同时进行诱导转分化，观察到在诱导转分化的第10d，过表达RND1促进了细胞转分化过程，下调了FABP4的mRNA表达量（P＜0.01），上调了CD34、DLK1以及PPARG、CEBPA等基因的mRNA表达量（P＜0.01）。 4、克隆得到奶山羊RND1启动子区全长序列2688bp，通过5’端侧翼序列截短分析发现奶山羊RND1启动子的核心区域位于-329~+109bp。过表达CTCF下调了RND1启动子活性（P＜0.01），证明CTCF负调控RND1的表达。 综上所述，RND1可正调控乳腺前体脂肪细胞中CDH1及上皮极性相关基因SCRIB的表达，在诱导乳腺前体脂肪细胞转分化过程中RND1可促进细胞形态向上皮样细胞转变，并抑制脂滴生成相关基因FABP4的表达，同时该过程中RND1受到转录因子CTCF的负调控。
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