摘要
目的： 喉癌是头颈部常见的恶性肿瘤，绝大多数为鳞状细胞癌。早期喉癌的治疗可选择手术或放疗，而中晚期喉癌需要考虑患者身体状况，酌情选择手术、放疗、化疗和生物治疗等手段。近四十年来，尽管治疗方法不断改进，喉癌患者的5年生存率却没有提升。目前喉癌防治面临问题有:发病机制不明，缺乏有效预防措施，早期诊断率较低;治疗方案未能实现个体化，部分中晚期患者疗效欠佳，出现化疗耐药及放疗抵抗，治疗后遗症严重影响患者的生活质量。因此对喉癌进行分子分型，探讨不同亚型的分子特征，发展新的治疗手段和策略,对于提高喉癌患者生存率、改善其预后，具有重要意义。 方法： 1.从癌症基因组图谱(TCGA)和基因表达综合数据库(GEO)中分别获取126例与109例喉癌数据，进行无监督聚类分析以识别喉癌的分子亚型。使用GSEA软件分析不同喉癌分子亚型的富集功能并识别关键信号通路。使用GenCLiP3.0软件对差异表达基因进行文献关键词注释并构建相互作用网络，筛选出核心调节因子。 2.对核心调节因子的上游miRNA及下游靶基因进行生物信息学筛选及分子生物学验证，通过体外实验研究候选miRNA及靶基因在喉癌细胞中的增殖、迁移、克隆形成等生物学特征及其与EMT的关系。进一步通过动物实验检测核心调节因子调控靶基因对喉癌细胞体内生长的影响。免疫组化检测核心调节因子在喉癌组织中的表达情况。 3.为进一步研究核心调节因子对喉癌化疗耐药及放疗抵抗的影响，我们对已有的喉癌顺铂耐药株(Hep-2/CDDP)进行全转录组建库测序，分析差异表达的mRNAs、miRNAs与lncRNAs的生物学功能;并对miRNAs与mRNAs、lncRNAs与miRNAs、mRNAs与lncRNAs进行整合分析。进一步采用生物信息学方法分析喉癌核心调节因子参与化疗耐药及放疗抵抗情况。 结果： 1.通过无监督聚类分析将获自TCGA的喉癌样本分为C1和C2分子亚型。Kaplan-Meier生存分析显示不同亚型喉癌患者的预后差异显著，C2亚型预后更差。该分子分型与病理分级、性别和年龄相关，而与临床分期、TMN分期、HPV感染等无关。GSEA软件分析显示C2亚型喉癌富集的基因更具侵袭性，最显著的富集途径是Hedgehog信号通路。采用GenCLiP3.0构建的分子网络显示GLI1是网络的核心节点。从GEO数据库获取的喉癌样本也可以分为类似的两个亚型。 2.采用生物信息学筛选及分子生物学验证提示PTCH1是GL I1可能的靶基因,而hsa-mir-1293是GLI1的候选上游miRNA。在喉癌TU212细胞中过表达及沉默PTCH1后发现PTCH1可以促进细胞增殖、克隆形成、细胞侵袭;动物实验结果表明裸鼠成瘤能力增强。Western blot实验显示Snail、N-cadherin及Vimentin蛋白表达升高，而E-cadherin蛋白表达降低，提示PTCH1可能促进了喉癌细胞EMT的发生。在喉癌TU212细胞中过表达及抑制hsa-mir-1293后，发现过表达hsa-mir-1293可以抑制细胞增殖、克隆形成及细胞侵袭。转染hsa-mir-1293mimic及GLI1的报告基因质粒，提示hsa-mir-1293可以靶向GLI1基因。免疫组化显示GLI1在喉癌组织中高表达。 3.对Hep-2/CDDP细胞及Hep-2细胞测序分析发现差异表达基因中有399个上调基因，580个下调基因，构建的分子相互作用网络核心基因为血管内皮生长因子A(VEGFA)和蛋白激酶B1(PKB1);筛选出4个差异表达的lncRNAs:MALAT1、LINC01315、AC092757.3和LINC01822;筛选出差异表达miRNAs共63个，其中有38个下调的miRNAs,25个上调的miRNAs;整合分析提示miRNA与lncRNA广泛的参与了喉癌顺铂耐药机制。通过比对喉癌TCGA中C2亚型上调基因与Hep-2/CDDP细胞上调基因的交集最多，提示喉癌C2亚型参与CDDP耐药可能性大，且GLI1也在CDDP耐药株中表达上调。采用GenCLiP3.0构建不同喉癌亚型放疗抵抗相关基因相互作用网络，可发现C2亚型的基因网络明显比C1亚型复杂，GLI1也参与其中。因此C2亚型富集放疗抵抗相关基因，可能会导致放疗敏感性不如C1亚型。 结论： 根据喉癌分子表达的差异可将其分为2个亚型，在更具侵袭性的C2亚型中最显著富集Hedgehog信号通路,GLI1是核心调节因子。GLI1调控靶基因PTCH1参与了喉癌细胞的增殖、迁移、EMT及体内成瘤。而hsa-mir-1293可以靶向GLI1基因。C2亚型可能与喉癌化疗耐药及放疗抵抗相关，提示GLI1及PTCH1是潜在的喉癌治疗靶点。
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