摘要
目的：脱钙骨基质（demineralized bone matrix, DBM）作为一类典型的同种异体骨移植材料，具有良好的生物活性及生物相容性，然而大量研究表明DBM骨诱导活性受到诸多因素（如供体年龄、种属、灭菌方式以及粒径大小等）的影响，其中粒径大小是值得研究的制备因素之一。本研究将小鼠成骨细胞系MC3T3-E1与不同粒径DBM共培养，通过对细胞增殖、分化及凋亡的观察，用以评价粒径大小对DBM生物活性及生物相容性的影响。 方法：本研究中，DBM骨材料首先根据泰勒标准筛网进行粒径筛选，筛选后DBM粒径分为四组：0.6~1.0mm组、2.2~2.6mm组、3.8~4.2mm组和5.4~5.8mm组。在进行细胞学实验之前，先对各组DBM的表面形貌结构进行评价，通过傅里叶变换红外光谱法检测Ⅰ型胶原结构，激光共聚焦显微镜检测表面粗糙度。之后将MC3T3-E1细胞与各组DBM共培养，细胞增殖评价采用CCK-8 法，并绘制细胞增殖曲线及计算细胞增殖率进行比较；对于细胞分化，定性检测主要是通过茜素红染色及ALP染色，定量评价则是通过荧光定量PCR法对OCN、OPN、ALP、Runx-2及Ⅰ型胶原五种蛋白基因表达水平进行检测；细胞凋亡方面，进行了流式细胞学实验、DNA损伤彗星实验以及凋亡相关基因PCR定量检测，此外，还对细胞进行了live/dead染色，用以评价DBM的生物相容性。 结果：傅里叶变换红外光谱结果显示，0.6~1.0mm、2.2~2.6mm、3.8~4.2mm 和5.4~5.8mm四组DBM骨材料的胶原结构内酰胺Ⅰ带、Ⅱ带的吸光波长均较天然胶原结构的吸光波长短，四组表面粗糙度分别为：4.69±1.27μm、2.50±0.69μm、3.27±0.71μm和5.45±1.39μm（F = 12.64，p＜0.05）。细胞增殖方面，相比于对照组，四组DBM骨材料均能够促进细胞增殖；共培养4 d前，细胞增殖速率为：随着粒径增大，细胞增殖速率越来越慢；共培养4-7 d，粒径较大的DBM组细胞增殖较粒径较小的DBM组细胞增殖快；共培养7 d以后，各组细胞增殖快慢情况无明显差异。茜素红染色及ALP染色结果均表明粒径为0.6~1.0mm的DBM更有利于成骨细胞的分化，进一步进行荧光定量PCR检测，结果显示粒径大小并不会改变基因表达随时间的变化规律，但 0.6~1.0mm 组基因整体表达水平较高。细胞凋亡相关检测及live/dead染色结果均表明，粒径大小不会影响DBM的细胞相容性，各组DBM均具有良好的细胞相容性，有利于细胞的存活。 结论：本研究首先证实粒径大小对 DBM 骨粒的结构特征有重要影响，不同粒径的DBM具有独特的结构特征，研究中四组DBM骨粒的Ⅰ型胶原结构（酰胺Ⅰ带、酰胺Ⅱ带）和表面粗糙度均有所差异。体外细胞学实验证实，粒径大小不会影响DBM的细胞相容性，各组DBM均具有良好的细胞相容性，有利于成骨细胞的存活；基于对成骨细胞增殖、分化和凋亡的观察及检测，在一定的粒径范围内，粒径较小的DBM骨材料具有更好的生物活性，就本组粒径而言，笔者希望在今后关于 DBM 粒径大小的骨组织工程研究中，研究者可以更多地选择使用0.6~1.0mm组的DBM颗粒，这将使研究人员在不同的研究目的中获得更具有可比性和可靠性的结果。
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