摘要
经典名方一贯煎是清代医家魏之琇所创，用于治疗肝病的著名方剂，因其疗效确切，传承至今仍在临床广泛应用，具有极大的开发价值。2018年国家公布了首批一百首来源于古代经典名方的方剂，一贯煎名列其中。基于对经典名方研发高质量要求，国家发布了一系列指导原则，以规范经典名方研发，同时指出质量控制研究是经典名方研发技术难点之一。质量控制贯穿经典名方研发的整个过程，是保障经典名方质量的重要手段。然而经典名方由于其组成的复杂性，使得定量控制一般只能选取含量较高的成分进行定量，难以反应所有药材的质量追溯情况。为此本课题提出了基于全过程高覆盖的定量控制研究思路，通过一贯煎系统的物质基础表征，筛选一贯煎中代表各个药味的相对高含量特征性成分，选择目前中国药典可接受的高效液相色谱-单四极杆质谱建立定量控制方法，以探索高覆盖的定量控制思路对经典名方生产全过程监控的质量评价作用，为经典名方的质量的提升提供新的思路和方法。本课题研究内容分为以下四个方面： 1.一贯煎化学成分全面表征。基于超高效液相色谱串联线性离子阱静电场轨道高分辨质谱（UHPLC/LTQ-Orbitrap HRMS）技术，首先采集一贯煎、单味药及其阴性制剂的高分辨质谱数据，然后通过对照品指认、文献报道，并结合高分辨液质数据处理软件（MS-DIAL，V4.92）快速匹配的方法，实现对一贯煎及其单味药的化学成分全面表征。研究结果，生地水提物中共鉴定出131个化合物，主要有环烯醚萜苷类、苯乙醇苷类、糖类和紫罗兰酮类化合物；枸杞水提物中共鉴定出116个化合物，主要有亚精胺类、苯丙素类、有机酸类和酰胺类化合物；当归水提物共鉴定出95个化合物，主要有苯酞类、有机酸类、氨基酸类、糖类化合物、核苷类化合物；麦冬水提物共鉴定出88个化合物，主要有甾体皂苷类、高异黄酮类化合物；在北沙参水提物共鉴定出28个化合物，主要有香豆素类和有机酸类化合物；川楝子单味药水提物共鉴定出34个化合物，主要为三萜类化合物。一贯煎中共鉴定出388个化合物，其中来源于生地的123个，枸杞的86个，麦冬的65个，当归的64个，川楝子的29个，北沙参的21个化合物；包括环烯醚萜类55个、亚精胺类43个、甾体皂苷类42个、三萜类17个、苯丙素类29个、有机酸类28个、紫罗兰酮类18个、高异黄酮类15个、香豆素类15个、苯乙醇苷类14个、糖类14个、氨基酸类9个、黄酮类8个、生物碱8个、其他52个。 2.一贯煎高覆盖定量特征成分的选择和确定。针对一贯煎质量控制研究中高覆盖指标成分选择的难点，基于高分辨液质联用数据处理软件（Progenesis QI，V2.4）构建了一贯煎高覆盖质量控制指标成分选择的有效策略和方法。该方法以Progenesis QI软件导出峰表中的丰度值（Abundance）为计算指标，依次按照条件①AYGJ-ABlank≥5?104（去除背景干扰，且保证高丰度）、②A 单味药-AYGJ≥0（保证强特征）、③AYGJ/A 阴性≥102（阴性比对，保证专属性）进行特征离子筛选，再结合质量亏损过滤（MDF）技术和全成分表征基础，确定了高覆盖定量和半定量特征成分共13个，涵盖7种类型化合物，所有药味均被监测，达到高覆盖质量控制的目标。 3.一贯煎高覆盖质量控制方法的建立。基于超高效液相色谱串联小型单四极杆质谱检测器（UPLC/QDa）技术，该技术具有分析范围广、灵敏度高、操作简便、经济实用的优点。应用多离子监测（Multiple Ion Monitoring，MIM）模式建立了同时监测一贯煎中13个特征成分的高覆盖定量分析方法。经方法学验证，专属性良好，8个定量成分在设定浓度范围内线性关系良好，重复性、稳定性、日间精密度的结果符合要求，平均加样回收率在79.88%-116.10%之间，均符合中国药典要求，表明所建立的分析方法准确、可靠，可用于一贯煎的质量控制。 4.一贯煎的全过程样品质量分析。通过建立的一贯煎UPLC/QDa多指标成分定量分析方法，对一贯煎进行生产全过程质量分析。结果表明，首先，所建立的定量分析方法可以对各个工序样品（药材/饮片水提物、中间体、制剂）中13个指标成分可以稳定检测，达到对一贯煎生产全过程样品质量监控的目标。其次，首次发现了一贯煎生产全过程对高覆盖定量指标的影响，如当归中的藁本内酯受干燥过程影响较大，花椒毒素受药材皮层的影响等。该研究方法较好的展示了不同药材受不同工艺过程影响，展现了相比传统质量控制更好的质量控制精准性。 通过上述研究表明，基于高覆盖全过程定量的质量控制策略能够反映出所有药味在经典名方生产过程的变化，能够更好的定量追溯每一味药材在最终产品中的情况，能够更精准的了解产品的一致性，显示了该研究策略具有的独特优势，为经典名方复杂体系质量控制研究提供了新的思路和方法参考。
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