摘要
2 型糖尿病肝损伤是一种以在 2 型糖尿病发生发展过程中出现的肝组织学/肝功能异常为临床特征的慢性并发症，目前临床仅以对症治疗为主，尚无治愈药物。藏药绿萝花为瑞香科结香属植物滇结香Edgeworthia gardneri （Wall. ）Meisn.的干燥花蕾，药用历史悠久，常用于“三高”和心血管疾病的预防和治疗，滇结香的花蕾在汉族民间则常作“密蒙花”使用，具有养肝明目之功效。基于藏汉两民族对绿萝花的不同药用，前期研究中证明绿萝花既有降糖（2 型糖尿病）作用，也有保肝（CCl4所致肝损伤）作用，提示绿萝花可能具有抗2型糖尿病肝损伤作用。本研究对其进行药效学验证、物质基础及作用机制研究，具体研究方法及结果如下： 1、藏药绿萝花D60部位抗2型糖尿病肝损伤药效学验证： 1）建立链脲佐菌素联合高糖高脂诱导的2型糖尿病肝损伤大鼠模型，连续灌胃给药42d，通过病理切片观察2型糖尿病肝损伤大鼠的肝组织病变情况，利用ELISA试剂盒检测2型糖尿病肝损伤血清指标TC、TG、ALT、AST、TBA、TBIL。结果表明藏药绿萝花 70%乙醇提取物的 60%乙醇大孔树脂洗脱部位（D60 部位）可降低2型糖尿病肝损伤大鼠空腹血糖水平，降低其肝指数，改善其肝组织病理变化，同时其可显著降低2型糖尿病肝损伤大鼠血清中TC、TG、ALT、AST、TBA、TBIL水平，且呈剂量依赖性。 2）采用蛋白免疫印记技术探究藏药绿萝花D60部位抗2型糖尿病肝损伤的作用机制。结果表明，藏药绿萝花D60部位可显著降低AMPK、PPAR-γ蛋白的表达水平，并明显升高NF-κB蛋白的表达水平，因此推测藏药绿萝花D60部位抗2型糖尿病肝损伤可能是通过调控AMPK/PPAR-γ/NF-κB通路实现的。 2、绿萝花抗2型糖尿病肝损伤有效部位谱效关系研究： 1）利用UPLC-QTOF-MS技术，构建10批次藏药绿萝花D60部位指纹图谱，显示其有22个共有峰；并根据质谱碎片离子信息，推测出18个单体化合物，分别为伞形花内酯（1）、结香苷C（2）、芦丁（3）、绿萝花苷 B（4）、异槲皮苷（5）、水杨酸（6）、绿萝花苷C（7）、山柰酚-3-O-芸香糖苷（8）、西瑞香素-5-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷（9）、紫云英苷（10）、开环异落叶松脂酚（11）、结香酸（12）、槲皮素（13）、繸状芸香苷酯（14）、银锻苷（15）、结香苷A（16）、山柰酚（17）、西瑞香素（18）。进一步与现有标准品比对，确定了其中的11个单体化合物，分别为伞形花内酯（1）、结香苷C（2）、芦丁（3）、异槲皮苷（4）、水杨酸（5）、山柰酚-3-O-芸香糖苷（6）、紫云英苷（7）、槲皮素（8）、银锻苷（9）、山柰酚（10）、西瑞香素（11）。 2）采用STZ联合高糖高脂建立2型糖尿病肝损伤大鼠模型，对10批次藏药绿萝花D60部位抗2型糖尿病肝损伤作用进行了评价。结果显示，10批次藏药绿萝花D60部位均可不同程度降低2型糖尿病肝损伤大鼠空腹血糖水平，改善其肝组织病理学改变，降低其血清中TC、TG、ALT、AST、TBA、TBIL水平。 3）以10批次藏药绿萝花D60部位指纹图谱中的22个共有峰峰面积和其药效学中TC、TG、ALT、AST、TBA、TBIL药效指标的抑制率为相关变量，利用皮尔逊相关分析，构建藏药绿萝花D60部位抗2型糖尿病肝损伤的谱效关系。研究结果表明，18个共有成分与TC抑制率相关性由大到小排序，分别为槲皮素、繸状芸香苷酯、芦丁、山柰酚、绿萝花苷C、银锻苷、西瑞香素-5-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷、开环异落叶松脂酚、结香苷A、西瑞香素、结香酸、异槲皮苷、绿萝花苷B、水杨酸、山柰酚-3-O-芸香糖苷、结香苷C、伞形花内酯、紫云英苷；与TG抑制率相关性由大到小排序，分别为绿萝花苷C、山柰酚、槲皮素、银锻苷、芦丁、繸状芸香苷酯、开环异落叶松脂酚、西瑞香素-5-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷、西瑞香素、结香酸、结香苷A、异槲皮苷、水杨酸、结香苷C、绿萝花苷B、山柰酚-3-O-芸香糖苷、紫云英苷、伞形花内酯；与ALT抑制率相关性由大到小排序，分别为绿萝花苷C、绿萝花苷B、水杨酸、异槲皮苷、伞形花内酯、芦丁、山柰酚-3-O-芸香糖苷、西瑞香素-5-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷、繸状芸香苷酯、开环异落叶松脂酚、山柰酚、结香酸、银锻苷、结香苷A、西瑞香素、紫云英苷、结香苷C、槲皮素；与AST抑制率相关性由大到小排序，分别为水杨酸、结香苷A、绿萝花苷B、芦丁、繸状芸香苷酯、异槲皮苷、伞形花内酯、结香酸、西瑞香素、结香苷C、绿萝花苷C、银锻苷、山柰酚、开环异落叶松脂酚、槲皮素、西瑞香素-5-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷、紫云英苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷；与TBA抑制率相关性由大到小排序，分别为绿萝花苷C、结香苷C、芦丁、繸状芸香苷酯、槲皮素、异槲皮苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷、西瑞香素-5-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷、水杨酸、绿萝花苷 B、伞形花内酯、开环异落叶松脂酚、结香苷 A、结香酸、山柰酚、银锻苷、紫云英苷、西瑞香素；与TBIL抑制率相关性由大到小排序，分别为gardnerol B、山柰酚-3-O-芸香糖苷、西瑞香素-5-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷、水杨酸、西瑞香素、山柰酚、异槲皮苷、紫云英苷、开环异落叶松脂酚、绿萝花苷C、伞形花内酯、繸状芸香苷酯、银锻苷、结香酸、芦丁、结香苷A、槲皮素、结香苷C。 3、藏药绿萝花D60部位11个单体成分抗2型糖尿病肝损伤的体外药效学验证： 1）借助油酸诱导人正常肝细胞LO2细胞，建立2型糖尿病肝损伤细胞模型，探究藏药绿萝花D60部位11个单体成分：伞形花内酯（1）、结香苷C（2）、芦丁（3）、异槲皮苷（4）、水杨酸（5）、山柰酚-3-O-芸香糖苷（6）、紫云英苷（7）、槲皮素（8）、银锻苷（9）、山柰酚（10）、西瑞香素（11），对2型糖尿病肝损伤药效学指标TC、TG、ALT、AST的影响。结果表明，在11个单体成分中，水杨酸、伞形花内酯、结香苷C、芦丁、异槲皮素、山柰酚-3-O-芸香糖苷、紫云英苷、槲皮素、银锻苷、山柰酚及西瑞香素可明显降低LO2细胞TC水平，结香苷C、芦丁、异槲皮素、紫云英苷、槲皮素和银锻苷可明显降低LO2细胞TG水平，水杨酸、伞形花内酯、结香苷C、芦丁、异槲皮素、山柰酚-3-O-芸香糖苷、紫云英苷、槲皮素、银锻苷、山柰酚及西瑞香素可明显降低LO2细胞ALT水平，水杨酸、伞形花内酯、异槲皮素、紫云英苷、槲皮素、山柰酚及西瑞香素可明显降低LO2细胞AST水平。 2）借助油酸诱导人肝癌细胞HepG2细胞，建立2型糖尿病肝损伤细胞模型，探究藏药绿萝花D60部位11个单体成分：伞形花内酯（1）、结香苷C（2）、芦丁（3）、异槲皮苷（4）、水杨酸（5）、山柰酚-3-O-芸香糖苷（6）、紫云英苷（7）、槲皮素（8）、银锻苷（9）、山柰酚（10）、西瑞香素（11），对2型糖尿病肝损伤药效学指标TC、TG、ALT、AST的影响。结果表明，在11个单体成分中，结香苷C、芦丁、异槲皮素、山柰酚-3-O-芸香糖苷、紫云英苷、山柰酚及西瑞香素可明显降低HepG2细胞TC水平，水杨酸、伞形花内酯、结香苷C、芦丁、异槲皮素、紫云英苷、槲皮素、银锻苷、山柰酚及西瑞香素可明显降低HepG2细胞TG水平，水杨酸、伞形花内酯、结香苷C、芦丁、异槲皮素、山柰酚-3-O-芸香糖苷、紫云英苷、槲皮素及山柰酚可明显降低HepG2细胞ALT水平，水杨酸、伞形花内酯、结香苷C、芦丁、异槲皮素、山柰酚-3-O-芸香糖苷、紫云英苷、槲皮素及山柰酚可明显降低HepG2细胞AST水平。 以上研究结果表明，藏药绿萝花D60部位具有抗2型糖尿病肝损伤作用，初步推测其药效物质基础可能与伞形花内酯、结香苷C、芦丁、异槲皮苷、水杨酸、山柰酚-3-O-芸香糖苷、紫云英苷、槲皮素、银锻苷、山柰酚、西瑞香素有关，其可能是通过调控AMPK/PPAR-γ/NF-κB通路实现的。
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