摘要
本课题以细辛挥发油(Asarum essential oils, AEO)为研究对象，研究其成分-毒/效的相关规律，建立细辛挥发油安全评价标准，确定细辛挥发油“减毒存效”的安全治疗窗，证实“减毒存效”的客观实效。研究不同形态催陈方法的适宜性和可行性，为快速制备高品质挥发油提供技术参考。本课题主要研究内容如下： 1、细辛挥发油成分与镇痛、神经毒性的相关靶点和通路的预测 采用网络药理学和网络毒理学对PubChem、NCBI、GEO、GeneCards、SwissTargetPrediction等数据库进行关键词为“细辛与牙痛”，“细辛与神经毒性”的数据挖掘，建立AEO与牙痛，AEO与神经毒性相关的网络关系，揭示AEO治疗牙痛和产生神经毒性的相关靶点和通路。通过网络图分析发现AEO通过肉豆蔻醚、γ-细辛醚和甲基丁香酚等关键成分影响PPARA、ACHE、SLC6A4、NOS3和HTR2A等靶点进而影响HIF-1信号通路、钙信号通路及5-羟色胺能突触，以实现治疗牙痛的目的。通过网络图分析发现细辛挥发油通过榄香素、γ-细辛醚和肉豆蔻醚等关键成分影响ACHE、ESR1和PARP1等靶点进而影响催乳素信号通路，出现神经毒性。 2、细辛挥发油抗炎镇痛作用研究 采用小鼠醋酸扭体模型进行细辛挥发油镇痛实验，以小鼠扭体次数作为评价指标。实验结果表明细辛挥发油低中高（107.92、161.88、215.84 mg/kg）剂量均有效减少了因醋酸造成的小鼠扭体现象，由44次减少至23次，证明AEO确实具有明显镇痛作用。通过脂多糖（LPS）诱导RAW264.7细胞炎症模型进行细辛挥发油抗炎活性研究，以炎症因子IL-6和TNF-α作为抗炎水平评价指标。实验证明，LPS诱导后RAW264.7细胞中TNF-α和IL-6的表达显著增加，AEO干预后，可降低炎症因子TNF-α和IL-6的增加（P ＜ 0.01），证明AEO确实具有抗炎活性。通过抗炎活性和镇痛作用证实AEO是细辛的主要药理活性成分。 3、细辛挥发油的毒性及机制研究 使用AB系斑马鱼模型进行AEO急性毒性实验，给药后观察胚胎形态和生存率，实验证明AEO对斑马鱼的半数致死浓度为0.174μL/mL(相当于170.346 mg/L)，根据鱼类急性毒性分级标准(GB/T21281-2207)， LC50gt;100 mg/L为低毒，表明细辛挥发油具有低毒性，高剂量给药可观察到其具有致畸性。 使用KM小鼠进行AEO急性毒性实验， LD50 为1.9116 g/kg，根据经口急性毒性分级标准，细辛挥发油口服具有低毒性。给药后观察到小鼠出现走路摇晃现象，呈醉酒状，分析其产生神经毒性。监测小鼠体重和脏器比，表明高剂量给药组与空白组相比具有显著性差异（Plt;0.05 ）。对小鼠血清和组织进行生化指标检测和组织病理学观察，小鼠血清和组织生化指标结果显示，肝组织中AEO组的AKP、ALT、AST和MDA的含量明显高于空白组，心脏组织中AEO组GSH含量显著降低（Plt;0.05）。组织病理学结果表明，给药后各组织均出现不同程度的损伤，组织结构紊乱，细胞核排列及走向紊乱，有炎性浸润等现象。 小鼠毒性实验观察分析AEO对小鼠产生神经毒性，为进一步考察其毒性机制，对小鼠脑组织进行转录组学检测与分析，预测细辛挥发油产生毒性的相关蛋白及通路。GO和KEGG的功能富集分析结果显示其主要富集在氧化还原酶活性（Oxidoreductase activity）、细胞凋亡（Apoptotic process）、线粒体内膜蛋白复合物（ Inner mitochondrial membrane protein complex ）、钙信号通路（ Calcium signaling pathway）和催产素信号通路（Oxytocin signaling pathway）等，推测AEO神经毒性与细胞凋亡和氧化应激相关。 4、细辛挥发油成分分离与毒效研究 上述实验结果表明细辛挥发油具有较好抗炎活性和镇痛作用，但同时存在低毒性，毒性存在影响其临床广泛应用，因此实现减毒至关重要。减毒的本质即物质基础改变，需首先了解细辛挥发油中影响毒效的相关成分。采用分子蒸馏技术对AEO进行成分分离和富集，研究不同馏分挥发油的化学成分、抗炎活性和毒性。 分子蒸馏将细辛原油（Crude oil, C）分离为3个馏分：重馏分（Heavy Fraction, H）、中馏分（Medium Fraction, M）和轻馏分（Light Fraction, L），H实现了甲基丁香酚和醚类成分富集，甲基丁香酚由原油中的24.0203%增加至31.3644%，醚类成分由69.4369%增加至86.2078%；而M和L中单萜烯类成分实现富集，Lamp;nbsp;中α-蒎烯和β-蒎烯相对百分含量之和为39.5302%，是原油的5倍，醚类成分仅含有5.8280%，是原油的0.08倍。 通过LPS诱导RAW264.7细胞炎症模型实验研究表明，与模型组相比，AEO及3个馏分TNF-α和IL-6的表达明显降低（P ＜ 0.01），发挥抗炎作用，抗炎活性大小为Lgt;Mgt;H/C。根据成分-抗炎活性相关性分析可知，影响AEO抗炎活性的物质主要包括：甲基丁香酚、肉豆蔻醚、α-蒎烯和β-蒎烯。 小鼠急性毒性实验结果表明C、H和M的 LD50 分别为：1.8852、1.9566和3.6741 g/kg，而L在给药剂量升至为5.1349 g/kg时，小鼠死亡率为0。证明L的毒性远小于C、H和M，M毒性与C相比明显降低（P ＜ 0.01），H与C毒性相近。根据成分-毒性相关性分析可知，与AEO产生毒性相关的主要化学成分包括黄樟醚、甲基丁香酚和肉豆蔻醚等醚类物质。 利用PC12细胞进行细辛挥发油神经毒性分析，结果证实细辛挥发油可诱导PC12细胞线粒体发生氧化损伤和功能障碍，细胞形态发生明显变化，细胞核异常，凋亡细胞增多。采用Annexin V-FITC双染法检测了AEO处理的PC12细胞凋亡率，结果显示，AEO处理后，PC12细胞凋亡率增加，表明AEO能诱导PC12细胞凋亡。实验结果表明AEO产生神经毒性与细胞凋亡和氧化应激相关。AEO中甲基丁香酚和肉豆蔻醚等是发挥药效和毒性的共性成分，正确把握其比例变化是实现“减毒存效”的关键。 5、阐明细辛挥发油“成分-毒/效”的关系，建立“醚/烯比值”安全评价标准 根据相关性分析结果表明细辛挥发油中甲基丁香酚、黄樟醚和肉豆蔻醚不仅是细辛挥发油中有效成分，也是其主要的毒性成分。因此，需要控制AEO毒-效相关性成分含量，建立符合AEO安全评价标准，从而实现“减毒存效”的目标。采用分子蒸馏技术分离制备8个含有AEO特征性成分的组分（A-H）。使用GC-MS进行成分分析，斑马鱼急毒考察挥发油毒性，LPS诱导RAW264.7细胞炎症模型研究挥发油抗炎活性。 GC-MS结果表明在8个组别中，醚类相对百分含量分别为：61.11、67.11、71.36、37.03、68.25、70.63、68.59和53.79%；单萜烯类相对百分含量分别为：16.12、4.25、13.91、52.45、6.10、5.50、9.46和33.49%。IL-6和TNF-α的含量结果表明与LPS诱导模型组相比，地塞米松组和A-H组3种浓度（0.5、0.25和0.125μL/mL）的释放量呈下降趋势，具有显著性差异（Plt;0.05）。斑马鱼毒性实验结果得到8个组分斑马鱼毒性大小为：F、Ggt;Egt;Bgt;Cgt;Agt;Hgt;D。 将斑马鱼的毒性结果与6种形式成分含量进行相关性分析：?醚类百分含量；?单萜烯类相对百分含量；?醚类和单萜烯类相对百分含量之比；?甲基丁香酚、黄樟醚、3,5-二甲氧基甲苯、3,4,5-三甲氧基甲苯和肉豆蔻醚相对百分含量之和；?甲基丁香酚和黄樟醚相对百分含量之和； 6、细辛挥发油陈化规律及机制的研究 采用自然陈化、物理催陈和炮制催陈等方法进行细辛挥发油减毒研究，使用GC-MS进行成分检测，电子鼻、旋光仪、折射仪用于测定细辛挥发油的香气、旋光度和折光度。 自然陈化对挥发油理化性质的影响：将提取的细辛挥发油放置在阴凉柜中（2-8℃），分别在第0、30、60、90、180和360天取样储存在-20℃冰箱中备用。通过GC-M成分分析表明，细辛挥发油自然陈化过程各成分相对含量无明显变化，而绝对含量在减少。斑马鱼的急毒实验表明，陈化360天后细辛挥发油LD50 为0.195μL/mL，与提取当天细辛挥发油 LD50 相比（0天，0.174μL/mL）无显著性差异。小鼠的急毒性实验结果表明，陈化360天后细辛挥发油 LD50 与提取当天的细辛挥发油 LD50 相比无显著性差异。 物理催陈对细辛挥发油理化性质影响：用红外光、紫外光、白炽光、高温和微波对细辛挥发油陈化进行干预，检测不同催陈条件下挥发油的理化性质，探讨催陈对细辛挥发油理化性质的影响，寻找实现“减毒存效”的催陈工艺。结果表明微波催陈对细辛挥发油的理化性质产生影响，900W密闭催陈后细辛挥发油单萜烯类成分减少，而醚类成分增加。 综上，通过细辛挥发油成分-毒/效相关性研究，建立以“醚/烯比”为指标的细辛挥发油安全评价标准。探讨陈化方法对细辛挥发油“减毒存效”可行性分析，阐明炮制催陈减毒的机理，为有毒芳香中药提供减毒的新思路。
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