摘要
研究目的： 本研究通过在体对肥胖小鼠施加运动、70%饮食控制、饮食控制联合运动和离体对骨髓间充值干细胞（Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells，BMSCs）施加机械牵拉、鸢尾素（Irisin）和整合素αVβ5（Integrin-alphaV-beta 5，IntegrinαVβ5）沉默/过表达等干预，探究Irisin/IntegrinαVβ5信号通路在调控BMSCs成骨/脂分化中的作用，为揭示肥胖性骨质疏松症的分子机制提供实验依据，也为寻找有效的防治方法提供可靠的理论依据。 研究方法和材料： 第一部分 饮食控制/有氧运动对肥胖小鼠骨质量及Irisin/IntegrinαVβ5信号通路的影响 1．实验动物与分组：60只刚断乳的雄性C57BL/6小鼠，随机分为标准饲料组（Normal diet group，ND组，喂养标准饲料，10只）和高脂饲料组（High fat diet group，HFD组，喂养高脂饲料，50只）。喂养高脂饲料10周后，将肥胖造模成功小鼠随机分成四组：肥胖对照组（Obesity control group，OC，n=10）、肥胖饮食控制组（Obesity calorie restriction group，OR，n=10）、肥胖有氧运动组（Obesity exercise group，OE，n=12）、肥胖饮食控制联合有氧运动组（Obesity calorie restriction combined with exercise group，ORE，n=12）。同时将标准饲料组小鼠设为正常对照组（Normal control group，NC，n=10）。OR和ORE组小鼠自第11周开始逐渐减少进食量，第13周后开始控制进食量为OC组的70%，直到第18周干预结束。OE和ORE组小鼠从第11周开始通过递增运动时间和运动速度的方式增加跑台运动负荷，第12周后运动负荷固定在20m/min，60min/d，坡度0度，直到第18周干预结束。 2．检测方法：采用Micro-CT扫描方法获得小鼠股骨骨体积（Bone volume，BV）、组织体积（Tissue volume，TV）、骨小梁体积分数（Percent bone volume，BV/TV）、骨小梁数量（Trabecular number，Tb.N）、骨小梁厚度（Trabecular Thickness， Tb.Th）、骨小梁分离度（Trabecular separation，Tb.Sp）、连接密度（Connection density，Conn.Dn）和结构模型指数（Structure model index，SMI）参数，并进行3D松质骨结构重建；通过三点弯曲实验法检测股骨最大载荷、破坏载荷、弯曲强度和弹性模量材料力学性能指标；采用酶联免疫法（ Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA）方法检测小鼠血清中鸢尾素（Irisin）、骨钙素（Osteocalcin，OCN）、骨碱性磷酸酶（Bone alkaline phosphatase，BALP）和抗石酒酸酸性磷酸酶-5b（Tartrate resistant acid phosphatase-5b，TRACP-5b）浓度；采用Hamp;E染色法观察小鼠股骨骨髓脂肪细胞形态，并统计骨髓脂肪细胞数量和体积。 第二部分 Irisin和牵张应力调控BMSCs成骨/脂分化的作用及机制 1．BMSCs中IntegrinαVβ5的检测：使用完全培养基、成骨和成脂培养基分别培养C57BL/6小鼠BMSCs7天后，再采用Western-blot和PCR技术检测BMSCs是否存在IntegrinαVβ5的表达。 2．筛选Irisin剂量：分别使用不同浓度Irisin（0、50、100和500ng/ml）干预BMSCs细胞，通过 CCK-8实验检测细胞增殖，并通过 PCR技术检测成骨（TGFβ1/p38MAPK/Runx2）和棕色脂肪因子（PRDM16/CIDEα/UCP1），以筛选Irisin最佳剂量，并采用该剂量对BMSCs进行干预。 3．筛选机械牵张强度：在FX-5000 Tension System设置0%、2%、4%和8%强度机械牵张刺激，对BMSCs进行每天1次的机械牵张刺激（Stretch）。实验结束后，通过CCK-8实验检测细胞增殖，使用PCR技术检测上述成骨/棕色脂肪因子mRNA，以筛选牵张应力最佳强度，并采用该强度对BMSCs进行干预。 研究结果： 第一部分：饮食控制/有氧运动对肥胖小鼠骨质量及Irisin/IntegrinαVβ5信号通路的影响 1．肥胖组： （1）与NC组相比，OC组小鼠BV/TV、Tb.N和Conn.Dn（Plt;0.05）明显降低， Tb.Sp明显增加（Plt;0.05）。3D重建图片显示，OC组小鼠骨微结构受到严重的破坏。 （2）与NC组相比，OC组小鼠血清Irisin、OCN和BALP浓度均明显降低（P＜0.05），血清TRACP-5b浓度则明显升高（P＜0.05）。 （3）与NC组相比，OC组小鼠最大载荷、破坏载荷和弯曲强度明显降低（P＜0.05）。 2．饮食控制/有氧运动干预组： （1）与OC组相比，OR组BV/TV、Tb.N和Conn.Dn明显增加（Plt;0.05），OE和ORE组BV、BV/TV、Tb.N和Conn.Dn明显增加（Plt;0.05），OR组的Tb.Sp明显降低（Plt;0.05），OE和ORE组的Tb.Sp和SMI明显降低（Plt;0.05）；与OR相比，ORE组小鼠BV/TV、Tb.N和Conn.Dn升高更明显（Plt;0.05）。 （2）与OC组相比，OR组最大载荷和弯曲强度明显升高（P＜0.05），OE和ORE组最大载荷、破坏载荷、弯曲强度和弹性模量明显升高（P＜0.05）。 （3）与OC组相比，OR、OE和ORE组血清中Irisin和OCN浓度均明显升高（P＜0.05），ORE组血清中BALP水平也明显升高（P＜0.05），OE和ORE组血清中TRACP-5b浓度均明显降低（P＜0.05）；与OR和OE组相比，ORE组小鼠血清Irisin、BALP和OCN浓度明显更高（P＜0.05）；且与OR组相比，ORE组小鼠血清TRACP-5b水平明显降低（P＜0.05）。 第二部分：Irisin和牵张应力调控BMSCs成骨/脂分化的作用及机制 1．BMSCs细胞存在IntegrinαVβ5的表达，Irisin最佳剂量为100ng/ml，牵张应力最佳强度为4%stretch。 2．成骨分化条件下： （1）与control组相比，Irisin、stretch和Irisin+stretch组ALP酶活性、钙结节数量和OD570值明显升高（P＜0.05）。与Irisin和stretch组相比，Irisin+stretch组ALP酶活性、钙结节数量和OD570值更高（P＜0.05）。 （2）与control组相比，Irisin、stretch和Irisin+stretchFNDC5、TGFβ1、p38MAPK和RUNX2的mRNA水平明显升高（P＜0.05），但各干预组IntegrinαV和Integrinβ5的mRNA无显著变化（P＞0.05）；与Irisin和stretch组相比，Irisin+stretch组TGFβ1、p38MAPK和RUNX2的mRNA水平更高（P＜0.05）。 3．成脂分化条件下： （1）与control组相比，Irisin、stretch和Irisin+stretch组脂滴形成明显减少，OD520值明显降低（P＜0.05）；与Irisin和stretch组相比，Irisin+stretch组脂滴形成最少（P＜0.05），OD520值最低（P＜0.05）。 （2）与control组相比，Irisin、stretch和Irisin+stretch组FNDC5、PRDM16、CIDEα和UCP1的mRNA水平明显升高（P＜0.05），白色脂肪因子ASC-1、HOXC8和HOXC9的mRNA水平明显下降（P＜0.05），但各干预组IntegrinαV和Integrinβ5的mRNA无显著变化（P＞0.05）；与Irisin和stretch组相比，Irisin+stretch组棕色脂肪因子mRNA水平明显更高，白色脂肪因子mRNA水平明显更低（ P＜0.05）。 研究结论： 1．肥胖引起Irisin/IntegrinαVβ5信号通路损伤，BMSCs成骨/脂分化失衡，骨微结构破坏，力学性能下降，可能是诱发肥胖性骨质疏松的原因之一。 2．饮食控制、有氧运动和联合干预可能通过改善骨中Irisin/IntegrinαVβ5信号通路信号损伤，缓解BMSCs成骨/脂分化失衡，改善骨髓脂肪异常增多和骨微结构破坏，提高骨形成和骨强度，逆转肥胖性骨质疏松，且联合干预效果好于单一干预。 3．牵张应力可以通过Irisin/IntegrinαVβ5上调成骨因子TGFβ1/p38MAPK/Runx2表达和棕色脂肪因子PRDM16/Cideα/UCP1的表达，调控BMSCs分化。
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