摘要
目的： 1.制备中空二氧化锰@司帕沙星/阿托伐醌@金属多酚网格-透明质酸(MSAMH)纳米颗粒并进行一系列表征。 2.评估MSAMH纳米颗粒的释药、产氧等性能。 3.评估MSAMH纳米颗粒的体外抗肿瘤活性。 4.评价MSAMH纳米颗粒的生物相容性和长期安全性。 5.探究MSAMH纳米颗粒的体内分布和体内抗肿瘤活性。 方法： 1.通过逐步合成法制备MSAMH纳米颗粒，利用透射电子显微镜观察纳米颗粒的形貌和尺寸,同时用动态光衍射仪测其水合粒径和电势，接着用傅里叶红外(FT-IR)、X射线光电子能谱(XPS)、X射线衍射(XRD)和热重分析(TGA)等测试对纳米颗粒进行进一步的表征以证明它的成功合成，最后通过紫外分光光度计测试并计算了纳米颗粒包载声敏剂司帕沙星(Sparfloxacin,SPX)与线粒体呼吸链抑制剂阿托伐醌(Atovaquone,ATO)的载药率和包封率。 2.利用紫外分光光度计检测MSAMH纳米颗粒分别在pH7.4、pH5.5和10mM谷胱甘肽(GSH)条件下药物的释放量并绘制药物随时间释放的变化曲线；利用溶解氧测定仪检测MSAMH纳米颗粒在弱酸、过氧化氢(H2O2)条件下的产氧效果；利用亚甲基蓝(MB)试剂评价MSAMH纳米颗粒通过类芬顿反应产生高毒性活性氧(ROS)的能力；利用单线态氧荧光探针(Singlet Oxygen Sensor Green,SOSG)评价MSAMH纳米颗粒在超声作用下产生单线态氧(1O2)的能力。 3.通过激光共聚焦显微镜观察小鼠乳腺癌细胞(4T1)经过不同处理之后，在不同时间点对纳米颗粒的摄取情况；利用2′,7′-二氢二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)为荧光探针评价4T1细胞内ROS产生的情况；利用Rhodamine123和JC-1探针评估MSAMH纳米颗粒对4T1细胞线粒体的损伤情况；以4T1、宫颈癌细胞(Hela)、人乳腺癌细胞细胞(MCF-7)为例验证纳米颗粒的体外抗肿瘤活性。 4.利用CCK8法检测MSAMH纳米颗粒对小鼠成纤维细胞(L929)的毒性作用以及不同功率超声对L929细胞的影响；利用小鼠新鲜红细胞评价MSMAH纳米颗粒的体外溶血情况；通过尾静脉注射MSAMH纳米颗粒30天后检测其血常规、血生化指标和组织脏器Hamp;E染色评价MSAMH纳米颗粒在体内的长期安全性。 5.建立小鼠肿瘤模型，通过小动物活体成像监测MSAMH纳米颗粒在体内的分布以及在肿瘤部位的富集；通过尾静脉注射MSAMH纳米颗粒后进行超声处理来评价纳米颗粒的治疗效果。 结果： 1.成功合成了MSAMH纳米颗粒，其中司帕沙星的载药量为5.3%，包封率为16.0%；阿托伐醌的载药量为10.3%，包封率为41.2%。 2.MSAMH纳米颗粒在弱酸、GSH环境下司帕沙星和阿托伐醌释放量分别可达到91.55%和72.84%，且纳米颗粒具有良好的产氧能力和类芬顿反应效果，在超声作用下还具有良好的单线态氧生成能力。 3.MSAMH纳米颗粒可以被肿瘤细胞有效摄取，在胞内可以产生ROS，通过共聚焦显微镜观察Rhodamine123和JC-1探针的荧光强弱发现纳米颗粒处理组的荧光明显弱于PBS处理的对照组；CCK8实验和Calcein-AM/PI活死染色评价了纳米颗粒对肿瘤细胞的优异杀灭作用，浓度为50μg/mL的MSAMH纳米颗粒超声处理4T1、MCF-7、Hela细胞后其存活率均低于21%。 4.MSAMH纳米颗粒与小鼠成纤维细胞共孵育后，细胞存活率仍未低于80%，且用不同功率超声处理小鼠成纤维细胞后发现2W/cm2处理60s几乎不会对正常细胞造成影响；MSAMH纳米颗粒与小鼠红细胞共孵育后其溶血率未高于国际标准的5%；小鼠尾静脉注射MSAMH纳米颗粒30天后，其血常规、血生化和组织切片分析均未发现明显异常。 5.荷瘤小鼠尾静脉注射纳米颗粒后在0、4、8、12、24h进行小动物活体成像，发现随着时间的推移肿瘤部位的荧光越来越强；24h后处死小鼠取其脏器进行荧光成像，观察纳米颗粒在脏器内的分布，发现肿瘤组织的荧光最强，且治疗后的肿瘤体积大小也逐渐减小。 结论： 1.MSAMH纳米颗粒在弱酸、GSH环境下能高效释放药物，且具有良好的产氧能力。此外，MSAMH纳米颗粒催化H2O2产生具毒性的羟基自由基(·OH)，在超声作用下MSAMH纳米颗粒还能产生大量单线态氧。 2.MSAMH纳米颗粒可以有效地靶向到肿瘤细胞并产生大量ROS，对线粒体也有一定的损伤作用。体外实验也证明MSAMH纳米颗粒具有优异的抗肿瘤作用。 3.通过与正常细胞孵育验证了纳米颗粒的低毒性，与红细胞孵育验证了其良好的血液相容性，且小鼠尾静脉注射纳米颗粒后其血生化、血常规和组织切片均无异常。以上实验结果均证明MSAMH纳米颗粒具有良好的生物相容性和安全性。 4.小动物活体成像结果表明，MSAMH纳米颗粒靶向效果明显，可以有效富集到肿瘤部位；体内抗肿瘤实验表明纳米颗粒对肿瘤治疗效果较好，可以有效抑制小鼠肿瘤的生长，达到了实验治疗的预期。
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