摘要
炎症小体在调节炎症和宿主防御肠道微生物中起至关重要的作用。NLRP6和NLRP9是NOD-like受体（NLR）家族的一员，作为一种胞质先天免疫传感器识别微生物相关的分子模式（MAMPs）和损伤相关分子模式（DAMPs）。感知激活信号后，NLRP6和NLRP9募集适配器凋亡相关斑点样蛋白（ASC）和炎性Caspase-11或Caspase-1,从而行使炎症小体的功能。这导致炎性的细胞因子IL-1β和IL-18的分泌和GSDMD介导的细胞焦亡。一方面NLRP6的严格调控对于维持组织稳态至关重要。另一方面NLRP6炎症小体激活不当会导致多种疾病的发生发展。目前肠上皮细胞中的NLRP6炎症小体被认为在调节肠道微生物组组成、杯状细胞功能以及对胃肠道炎症、病毒感染和肿瘤疾病的相关易感性方面发挥重要功能。然而调节NLRP6炎症小体以维持体内稳态和防止过度炎症发生的分子机制仍不清楚。同时，NLRP9依靠DHX9识别病毒RNA。DHX9抵抗病毒感染的机制还不明确。综合来看，NLRP6和DHX9同为RNA病毒感受器，其具体抵抗病毒感染的机制还有待进一步探索。 翻译后修饰在调节单个蛋白分子和蛋白复合体功能中发挥重要且广泛的作用。至今为止，许多具有修饰功能的分子在调节炎症小体激活中的新兴作用被报道。多种修饰酶通过与炎症小体成分结合并调控其翻译后修饰，从而调节炎症小体的活化。这些修饰包括磷酸化、苏木酰化、泛素化和乙酰化等。截至目前,NLRP6仅被报道能够被CYLD去泛素化。去泛素酶CYLD调节NLRP6炎症小体的功能，进而调控IL-18的产生来防止过度炎症的发生。机制上，CYLD切割 NLRP6的K63连接的泛素化，从而抑制了 NLRP6与ASC的相互作用。但是到目前为止，NLRP6具体的翻译后修饰位点仍没有被报道。同时稳态情况下NLRP6炎症小体功能的维持以及NLRP6是否存在其他关键的翻译后修饰仍不清楚。更重要的是，NLRP6炎症小体分子层面的的识别、组装、激活和调控的关键问题还不清晰。所以考虑到后续精准靶向干预，NLRP6的疾病相关的翻译后修饰和修饰位点亟待被鉴定。同时，病毒感受器DHX9大部分定位于细胞核,那么核内的DHX9是否通过NLRP9非依赖的途径发挥抗病毒功能还不明确。 对于NLRP6炎症小体，我们首次报道了 NLRP6在体内存在多位点单泛素化修饰。并且我们找到了多位点单泛素化修饰NLRP6的泛素连接酶UBE2O。具体来说，我们首先在小鼠的肠道上皮细胞当中用pulldown的方法鉴定到了NLRP6的结合蛋白UBE2O。我们在体内体外分别证明了 UBE2O特异地直接结合NLRP6而不结合NLRP3和NLRP9。并且两者都共同定位于细胞质。随后，我们发现UBE2O以酶活依赖的方式修饰NLRP6。同时我们利用不同的方法证明了 UBE2O是NLRP6的泛素连接酶，并能够多个位点单泛素化NLRP6。进一步我们利用生化的方法证明了 UBE2O分别修饰NLRP6的PYD、NATCH和LRR结构域。随后通过构建NLRP6的突变文库和筛选，我们首次鉴定到了 NLRP6不同结构域被泛素修饰的赖氨酸位点:K115-K130、K365-K455和K680-K687。并且我们证明了这些位点对于UBE2O介导的NLRP6多位点单泛素化是充分且必要的。进一步我们发现了 UBE2O以酶活依赖的方式促进了 NLRP6的胞质阻隔、寡聚、ASC招募和RNA识别。并且我们首次鉴定了 NLRP6的核定位信号K115-K130。最后我们首次在体内发现NLRP6存在明显的核质共定位和单泛素化修饰,并且利用UBE2O肠道上皮条件性敲除小鼠证明了 UBE2O对DSS诱导的结肠炎的保护作用。并且肠上皮敲除UBE2O显著促进了轮状病毒的感染。 对于NLRP9的病毒感受器DHX9,我们构建了髓系特异性和肝脏特异性的敲除小鼠，通过在DHX9缺陷小鼠中增加敲除线粒体抗病毒信号蛋白MAVS或转录激活因子STAT1,证明了 DHX9除了在细胞质中具有传统双链核糖核酸感应作用外，还充当细胞核中的转录共激活剂。在干扰素的刺激下，DHX9直接与细胞核中的STAT1结合，并将RNA聚合酶Ⅱ募集到干扰素刺激基因启动子区域，参与STAT1介导的干扰素刺激基因转录，促进干扰素刺激基因表达以拮抗RNA病毒。 综上所述，我们首次报道了 NLRP6的单泛素化修饰，并证明了肠道UBE2O-NLRP6轴对于维持肠道抗病毒稳态的重要性。今后，我们将进一步探究UBE2O-NLRP6轴在不同组织和层面的致病机理和生理意义，以期为相关的宿主防御机制和对慢性疾病开发有效的治疗策略提供重要的思路。同时，我们首次报道了核内DHX9发挥抗病毒功能的机制，这也为理解干扰素刺激基因的调控策略提空重要的思路。
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