摘要
新型冠状病毒（Severe acute respiratory syndrome coronavirus2,SARS-CoV-2）的流行对世界构成了巨大威胁，迫切需要一种有效的预防性疫苗。位于SARS-CoV-2棘突（S）基因的受体结合域（Receptor binding domain,RBD）负责与宿主细胞的血管紧张素转换酶2（Angiotensin-converting enzyme2,ACE2）受体结合。RBD蛋白是一种有效且安全的候选抗原。六螺旋束（6-helix bundle,6HB）“分子钳”是—种新的热稳定三聚结构域，来源于人类免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus,HIV）gp41蛋白片段。为此，本研究拟以RBD作为免疫原，通过与6HB融合，开展SARS-CoV-2新型亚单位疫苗研究。 本研究选择杆状病毒系统融合表达6HB和去糖基化的RBD蛋白，以模仿RBD的天然三聚体结构，使用pFastBac?1成功将目的基因转至DH10Bac?大肠杆菌中，利用辅助质粒将目的基因转座至杆状病毒基因中，成功构建出表达不同目的蛋白的三种重组杆状病毒：rBV-SARS-CoV2-RBD-6HB、rBV-SARS-CoV-2-RBD、rBV-6HB。分别接种于SF9悬浮细胞中，成功实现了三种目的蛋白（RBD-6HB、RBD、6HB）在细胞培养上清液中的分泌表达。 使用Strep-tag?II亲和层析方法对成功表达的RBD-6HB、RBD、6HB进行纯化，薄层色谱鉴定其纯度，结果显示，重组蛋白RBD-6HB纯度大于97%，RBD纯度大于99%，6HB纯度大于96%。同时对纯化后的目的蛋白RBD-6HB进行非还原性SDS-PAGE以验证其是否形成三聚体，结果表明，该RBD-6HB能够形成多聚体和三聚体。 将纯化后的RBD-6HB、RBD、6HB蛋白分别与Al(OH)3/CpG佐剂混合，通过肌肉注射免疫人源化BALB/c-hACE2小鼠，结果表明RBD-6HB和RBD组均可刺激动物产生持续的高水平抗体，并在攻毒保护试验中能够有效保护小鼠，降低其肺部病毒载量及肺部的炎症反应。相较于RBD组，RBD-6HB组表现出更有效的保护作用，表明多聚体的RBD能够更有效刺激小鼠产生特异性抗体，且在攻毒保护试验中保护效果高于单体RBD。上述研究结果表明多聚化RBD在设计SARS-CoV-2疫苗中的重要性，为SARS-CoV-2疫苗及其他新型亚单位疫苗研制提供了新的思路和理论依据。
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