摘要
目的: 睾丸衰老(testicular aging,TA)是男性生殖系统常见的现象，各种内源性和外源性因素皆可导致TA。TA除了会导致睾丸功能降低，进而影响精子的质量和数量、降低生育能力外，还可能影响男性的心理健康，引发抑郁等问题。但是目前改善TA的治疗方法是十分有限。而中医药在治疗TA方面具有多成分多靶点等天然优势，探究中医药治疗TA具有重要意义。大黄蛰虫丸(Dahuang Zhechong Pill,DHZCP),作为经典的中药复方具有一定的抗炎、抗氧化作用，笔者团队前期的研究也发现其对TA具有一定的改善作用，但是具体机制尚不清楚。本研究旨在探究DHZCP对TA的改善作用及其潜在作用机制。 方法: 网络药理学:通过中药系统药理学数据库和分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP)检索 DHZCP 各中药化学组成成分，挖掘GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)中TA的潜在靶点，通过Cytoscape 3.9.0软件构建DHZCP“药物-活性成分-靶点”网络，使用String11.0数据库(https://cn.string-db.org/)构建蛋白互作(PPI)网络模型，最后将DHZCP治疗TA的靶点录入DAVID平台，选择“homo sapiens”,进行基因本体论(Gene Ontology,GO)分析和(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析。 动物实验:24只雄性大鼠被随机分成4组(正常组、模型组、DHZCP组和维生素E(vitamin E,VE))组，连续腹腔注射D-半乳糖(D-galactose,D-gal)建立大鼠TA模型。实验期间内，DHZCP组和VE组大鼠每天经由DHZCP混悬液和VE混悬液灌胃干预，正常组与模型组大鼠灌胃同剂量生理盐水。三个月后处死大鼠并采集血液及睾丸组织，利用全自动生化分析仪检测血清中黄体生成素(uteinizing hormone,LH)、卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone,FSH)以及睾酮(Testosterone,T)含量;苏木精 —伊红(hematoxylin-eosin staining,HE)染色观察大鼠睾丸组织结构;衰老相关β -半乳糖苷酶(senescence-associated β -galactosidase,SA-β-gal)染色观察大鼠 TA 情况;免疫组织化学技术(immunohistochemistry,IHC)检测炎症相关因子肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)及凋亡性坏死信号通路蛋白磷酸化底物混合谱系激酶样蛋白(phosphorylation mixed lineage kinase domain like pseudokinase,p-MLKL)表达，并比较其组间差异;免疫蛋白印迹法(Western Blot,WB)检测细胞周期相关蛋白P21、P53、炎症相关因子TNF-α,凋亡性坏死信号通路蛋白受体相互作用蛋白激酶1(receptor interacting serine/threonine protein kinase 1,RIPK1)、受体相互作用蛋白激酶 3(receptor interacting serine/threonine protein kinase 3,RIPK3)、底物混合谱系激酶样蛋白(mixed lineage kinase domain like pseudokinase,MLKL)、天冬氨酸蛋白水解酶-8(cysteinyl aspartate specific proteinase 8,Caspase-8)的表达，并比较其组间差异。 细胞实验:利用不同浓度D-gal(0、50、100、150、200mM)干预小鼠精原细胞(GC-1细胞)24h,细胞计数试剂(Cell Counting Kit-8,CCK-8)检测其细胞活性，WB检测其细胞周期蛋白P21、P53与炎症因子TNF-α表达，SA-β-gal染色观察各组细胞衰老情况，并比较组间差异;使用TNF-α抑制剂依那西普(Etanercept,ENT)干预GC-1细胞，WB检测各组(Control组、Model组、ENT组)细胞周期蛋白P21、P53的表达，SA-β-gal染色观察各组之间细胞衰老情况，并比较各组之间差异;利用不同浓度DHZCP含药血清(5、10、15％)与150mM D-gal共同干预GC-1细胞24h,CCK-8检测其细胞活性，WB检测其细胞周期蛋白P21、P53表达，SA-β-gal染色观察各组细胞衰老情况，并比较组间差异;WB检测5组(Control组、Model组、DHZCP组、VE组、ENT组)GC-1细胞炎症相关因子 TNF-α、凋亡性坏死信号通路蛋白(RIPK1、RIPK3、Caspase-8、MLKL、p-MLKL)的表达，并比较其组间差异。 结果: 网络药理学:DHZCP主要活性成分为大黄素和大黄酸、黄芩素和黄芩苷等;DHZCP与 TA 主要有 MAPK14、NOS3、ESR1、NR3C1、HSP90AA1、JUN 等 40 个共同靶点;DHZCP与TA共同靶点主要GO以及KEGG富集于TNF、IL-17、TRP等信号通路;以上结果提示DHZCP可能是通过调控TNF等关键靶点来抑制TNF、IL-17、TRP等信号途径从而改善TA。 动物实验:在实验过程中发现经过DHZCP给药后，TA模型大鼠的体质量明显下降，睾丸总重量和睾丸指数也有所回升，对睾丸T、LH和FSH分泌与调节也出现了明显改善作用;对各组大鼠进行HE染色与SA-β-gal染色后也可以发现DHZCP对睾丸组织病理性损伤与衰老有明显的改善作用，WB检测细胞周期相关蛋白P21、P53的表达发现，DHZCP组的表达相较于模型组有所下降;对各组大鼠睾丸组织中的TNF-α进行了 WB与IHC检测,发现在给予DHZCP干预后相较于模型组TNF-α的表达出现了明显的下降;对凋亡性坏死相关蛋白的表达进行了 WB检测，其结果表现为给予DHZCP后RIPK1、RIPK3的表达量下降，Caspase-8表达增加，p-MLKL/MLKL的WB与IHC的结果都有所下降。 细胞实验:通过CCK-8检测不同浓度的D-gal（0、50、100、150、200 mM）干预24h后GC-1细胞的细胞活性可以观察到，与0mM干预条件下的GC-1细胞相比，150mM浓度干预下细胞活力没有出现明显的降低，但是细胞周期蛋白P21、P53的表达明显增加,SA-β-gal染色发现150mM浓度下的染色程度明显高于其余各组,WB技术检测了各浓度梯度下TNF-α的表达发现150mM时TNF-α表达明显高于其他各组;使用TNF-α抑制剂ENT对GC-1衰老细胞进行干预，WB检测其细胞周期相关蛋白P21、P53,发现其表达皆有所下降，SA-β-gal染色表明当TNF-α被抑制时其GC-1细胞衰老被明显改善;CCK-8检测不同浓度比例的DHZCP含药血清（5、10、15％）分别与150mM D-gal同时干预处理GC-1细胞24h后的细胞活力，其结果显示，15％DHZCP含药血清干预对D-gal诱导的GC-1细胞活力的提升最为明显，WB技术检测下P21、P53表达相较于Model组明显降低;各浓度梯度DHZCP含药血清干预下的GC-1进行SA-β-gal染色发现干预量为15％时的染色程度明显低于Model组，对各组细胞（Control组、Model组、DHZCP组、VE组、ENT组）中TNF-α表达进行了 WB检测，发现相较于Model组给予DHZCP干预后的GC-1衰老细胞的TNF-α表达出现了明显下降，其结果与VE组和DHZCP组相似;WB检测凋亡性坏死相关蛋白的表达进行了，其结果表现为给予DHZCP含药血清后RIPK1、RIPK3的表达量下降，Caspase-8表达增加，p-MLKL/MLKL的表达也出现了明显的降低。 结论: 大黄蛰虫丸能够抑制TNF-α的分泌与表达，从而调控其介导的凋亡性坏死信号通路的转导，进而抑制细胞发生凋亡性坏死，改善睾丸衰老。
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