摘要
据2020年GLOBOCAN数据可知，新发癌症中肺癌排第二位（11.4%），死亡率占第一（18%），非小细胞肺癌（Non-Small Cell Lung Cancer，NSCLC）占新发肺癌患者的绝大多数，约为85%。是世界范围内的医疗卫生沉重负担与难题。肺癌治疗不断迭代更新，精准肿瘤药物的概念逐渐形成，而开发新的靶点一直成为肺癌的研究热点。氯离子广泛存在于人体各种组织器官中，细胞内氯离子通道（Chloride Intracellular Channels，CLICs），目前发现共有6个亚型，CLIC1-CLIC6，主要在肿瘤生物学、心血管、炎症与免疫、神经退行性变中发挥作用。细胞内氯离子通道蛋白4（Chloride Intracellular Channel4，CLIC4）目前在CLICs家族中研究较为深入，除在膜电平衡、细胞内外离子稳态和跨膜转运中发挥作用，还被报道参与多种通路，可被TGF-β、P53、Myc、TNFα调控。而CLIC4在多种癌症中的表达及作用各异，据报道在胃癌、皮肤癌、前列腺癌为抑癌蛋白，在胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌等癌种中则充当促瘤蛋白。由于CLIC4在癌症中的作用存在诸多争议，不同癌种表现并不一致，且机制未完全阐明，其在NSCLC中的研究甚少，本实验拟以NSCLC为研究对象，研究CLIC4在NSCLC中的生物功能及机制。基于上述思考，本研究先利用生信分析手段，评估CLIC4在NSCLC癌与癌旁的表达差异，CLIC4对NSCLC患者的预后影响。并对CLIC4在癌中表达降低的生信结果进行了细胞系与癌组织的验证，还运用免疫荧光和外泌体提取验证CLIC4在NSCLC中的分布。成功构建过表达及敲低CLIC4的稳定细胞株，利用CCK8、克隆平板、迁移实验、基质胶侵袭实验验证其对NSCLC细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响。同时运用RNA-seq技术对过表达CLIC4及敲低CLIC4的细胞系进行转录组测序，进行GO、KEGG、PPI等生信分析。验证并探索转录组测序相关结论。还探索了CLIC4与凋亡的关系。该研究为CLIC4在NSCLC中的发病机制，作为诊断指标及潜在的治疗靶点提供了理论基础。 第一章 CLIC4在NSCLC中表达与分布 研究目的： 探索CLIC4在NSCLC中的表达情况与分布，其表达水平与患者生存期的关联情况。 方法： 1、利用TIMER2.0、UALCAN、HPA数据库对CLIC4在肺癌数据样本中进行差异分析。 2、利用Kaplan-Meier Plotter数据库分析CLIC4高低与患者预后关系。 3、收集NSCLC患者的组织标本，通过培养正常肺泡上皮细胞（BEAS-2B），NSCLC细胞系（H1975、H1299、HCC827、PC9、H358、H460、A549）。提取总RNA和蛋白分别进行q-PCR和western blot验证CLIC4的表达情况，选取原位腺癌与浸润性腺癌病理样本进行免疫组化染色。 4、免疫荧光染色观察CLIC4在BEAS-2B、PC9细胞中的蛋白分布。 5、电镜验证提取H1299、PC9细胞的外泌体成功，结合外泌体标记CD9、CD63，利用western blot验证CLIC4的表达。 结果： 1、TCGA来源数据库提示mRNA水平上，CLIC4在NSCLC组织中低于癌旁。CPTAC来源数据库分析LUAD样本，在蛋白水平上，CLIC4在LUAD为低表达。HPA数据库得出CLIC4在正常肺组织中免疫组化染色强于肺癌组织。 2、Kaplan-Meier Plotter数据库分析1925例肺癌病人中，高表达CLIC4的患者预后更好HR=0.8695%CI（0.75-0.97），中位生存期更长，进行log-rank检验后，具有统计学差异（P＜0.05）。亚组分析在LUAD中，高表达CLIC4的患者也拥有更好的生存率（P=0.0032）。 3、CLIC4在NSCLC细胞系、癌组织中转录和蛋白水平均更低。 4、免疫组化和免疫荧光提示CLIC4主要分布在细胞核外的胞浆中，但也可入核。 5、Western blot验证出H1299、PC9细胞的外泌体中存在CLIC4表达。 结论： 1、CLIC4在NSCLC中，无论是细胞水平、组织水平上表达均降低。高表达CLIC4在肺癌患者中提示更好的生存期。 2、CLIC4主要分布在细胞核外。可存在于NSCLC细胞系H1299、PC9的外泌体中。 第二章 CLIC4对NSCLC细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响 研究目的： 探究过表达CLIC4、敲低CLIC4对NSCLC细胞生物行为的影响。 方法： 1、选择H358、PC9细胞行CLIC4过表达，分别转染CLIC4过表达质粒与对应空载质粒，后进行抗性筛选，挑出单克隆培养后western blot验证过表达CLIC4效果。 2、选择H1299、PC9细胞行CLIC4敲低，转染shNC、shCLIC4#1、shCLIC4#2质粒，进行抗性筛选，挑出单克隆培养后western blot验证敲低CLIC4效果。敲低质粒携带GFP，也可在镜下观察转染效率。 3、构建成功后的细胞系进行CCK8、克隆形成、迁移实验、Matrigel侵袭实验 结果： 1、CCK8实验表明过表达CLIC4使得H358的生长受限制，具有统计学差异（P＜0.01），克隆形成能力也下降。在迁移和Matrigel侵袭实验中，H358CLIC4迁移的细胞与侵袭的细胞明显少于对照组。过表达CLIC4的PC9细胞也得到相同的结论。 2、CCK8实验表明敲低CLIC4对细胞增殖无显著影响（P＞0.05），克隆形成也支持该结论。在迁移和Matrigel侵袭实验中，H1299shCLIC4#2迁移的细胞与侵袭的细胞显著高于对照组。敲低CLIC4的PC9细胞也得到相同结论。 结论： 1、稳定过表达CLIC4后可抑制H358、PC9的增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力。 2、稳定敲低CLIC4促进了H1299、PC9的迁移和侵袭能力。对增殖无显著影响。 第三章 过表达与敲低CLIC4稳定细胞系转录组测序生信分析 研究目的： 探究稳定过表达与敲低CLIC4对细胞系转录组的影响，寻找相关通路变化。 方法： 1、构建稳定过表达CLIC4和敲低CLIC4PC9细胞系，连同其对照组送样测序，每个样品3次生物学重复。 2、对测序数据进行清洗后，进行质控。使用R语言进行分析，行火山图、差异基因热图、GO分析、KEGG分析等分析。 结果： 1、过表达CLIC4与其对照组（PC9CLIC4vs PC9EM）的火山图显示上调基因602个，下调基因618个。GO分类提示在炎症反应、质膜、细胞外区域、钙离子结合功能上富集。KEGG分析差异基因在Ras、MAPK、Rap1信号通路富集，也在风湿性关节炎、炎症调节通路上富集。 2、敲低CLIC4与其对照组（PC9shCLIC4vs PC9shNC）的火山图显示上调基因295个，下调基因283个。GO分析在差异基因在细胞外基质、上皮分化功能上富集。KEGG分析在肿瘤通路上富集。 结论： 1、过表达CLIC4引起的差异基因个数（1220个）明显多于敲低CLIC4引起的差异基因个数（578个）。并提示差异基因在MAPK、Ras、炎症等通路上富集。 第四章 CLIC4对NSCLC生物功能影响的机制研究 研究目的： 1、验证转录组测序结果通路变化与探索其他机制。 2、探究CLIC4与凋亡的关系。 方法： 1、在H358、PC9细胞稳定过表达CLIC4，用western blot验证过表达CLIC4对MAPK等通路上相关分子的影响。 2、用IgG抗体，CLIC4抗体在PC9细胞中IP蛋白样品进行质谱分析。 3、Western blot验证CLIC4表达改变是否影响上皮间充质转化过程。鬼笔环肽染色过表达CLIC4后的PC9细胞骨架是否变化。 结果： 1、在H358、PC9细胞中过表达CLIC4后可以减低Raf1、MEK1/2、ERK1/2的磷酸化水平。同时还发现，过表达CLIC4抑制了AKT磷酸化。CLIC4与Ras无直接相互作用。 2、在H358过表达CLIC4，在H1299敲低CLIC4均不引起EMT指标的明显改变。鬼笔环肽染色后观察PC9CLIC4与其对照组PC9EM无明显形态上改变。 3、随着星形孢素剂量增加，细胞活性逐步降低，PC9CLIC4与对照组对比，在星形孢素0.1μM、0.25μM、0.5μM、1μM干预条件下，细胞活性均更低，具有统计学差异。 结论： 1、在NSCLC中，过表达的CLIC4可抑制MAPK通路，抑制AKT的磷酸化，CLIC4不与Ras直接结合。CLIC4对NSCLC的迁移与侵袭能力改变不依赖传统的EMT变化。 2、高表达的CLIC4可引起NSCLC凋亡通路变化，在外源诱导凋亡情况下，与对照组相比，过表达CLIC4后的细胞凋亡进一步增加。
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