摘要
枣（Ziziphus jujuba Mill.）为鼠李科枣属木本经济林树种，也是原产我国的特色传统果树，因“药食同源”而倍受重视。五环三萜类化合物是枣果实中重要的生物活性物质，具有安神、抗癌、抗肿瘤、抗炎等药理作用。目前，关于五环三萜在枣生长发育过程中的时空代谢及其生物合成的分子机制尚不清楚。本研究以野生型‘清涧酸枣’和栽培型‘骏枣’为材料，结合转录组和三萜类代谢物分析，利用生理、分子生物学技术等对枣中重要五环三萜的动态积累模式、生物合成及转录调控机制研究，阐释枣五环三萜代谢调控网络，深化其功能性状形成的分子机制。主要研究结果如下： （1）三萜在枣生长发育过程中的代谢积累具有时空特异性。野生型‘清涧酸枣’中的总三萜高于栽培枣‘骏枣’。‘清涧酸枣’中的总三萜主要富集在芽（14979.5 mg/kg DW）和嫩叶（10016.1 mg/kg DW），在果实发育的白熟期（DAP80）达到峰值（16572.2 mg/kg DW）。‘骏枣’总三萜在嫩叶（10284.1 mg/kg DW）中含量最高，也是在果实白熟期达到峰值（10095.1 mg/kg DW），随后缓慢下降。枣中三萜类化合物主要是五环三萜，我们测定了7种五环三萜，包括美洲茶酸、科罗索酸、白桦脂酸、齐墩果酸、熊果酸、齐墩果酮酸和3-酮酸熊果酸，其中白桦脂酸、科罗索酸和熊果酸是‘清涧酸枣’和‘骏枣’中主要的五环三萜。不同组织中，五环三萜主要集中在芽和嫩叶中。果实不同发育阶段中，五环三萜主要积累在果实白熟期（DAP80）和初红期（DAP90），而且两种枣果实中的含量存在一定的差异性。三萜合成过程中，关键中间产物角鲨烯也主要在枣的芽和嫩叶中积累，‘清涧酸枣’中的角鲨烯主要在果实发育的幼果期（DAP20）和初红期合成积累，而‘骏枣’中的角鲨烯合成主要在幼果期和白熟期。 （2）利用转录组和三萜类代谢物分析，获得 21 个可能与三萜生物合成相关的候选结构基因和 8 个参与三萜生物合成的转录因子。在枣生长发育过程中，三萜物质含量与结构基因法尼基焦磷酸合成酶（ZjFPS）和角鲨烯合成酶（ZjSQS）的表达，具有极高的相关性，而且ZjFPS和ZjSQS基因在枣果实和烟草中瞬时过表达和沉默干扰后可显著提高和降低总三萜、五环三萜化合物以及角鲨烯的含量，而且 ZjSQS 对角鲨烯的影响程度要高于ZjFPS。亚细胞定位显示，ZjFPS和ZjSQS定位于细胞核和内质网中， ZjFPS和ZjSQS基因稳定转化大叶烟草‘NC89’，得到转基因烟草中的总三萜及科罗索酸的含量显著高于野生型（WT）。利用植物激素MeJA和SA处理酸枣实生苗，可诱导ZjFPS 和 ZjSQS 的表达水平，且能显著提高其总三萜含量。这些结果表明，ZjFPS 和ZjSQS是枣五环三萜生物合成的关键结构基因。 （3）通过转录组和实时荧光定量PCR技术，将筛选到的8个转录因子（ZjMYB39、ZjMYB4、ZjMYB308、ZjWRKY7、ZjWRKY11、ZjWRKY40、ZjbHLH96和ZjMYC2）进行枣生长发育过程中的表达分析，其中五环三萜类化合物含量与ZjMYB39和ZjMYB4基因表达量具有较高的相关性。亚细胞定位显示，ZjMYB39 和 ZjMYB4 定位于细胞核。ZjMYB39 和 ZjMYB4 基因瞬时过表达和瞬时沉默干扰，分别可显著提高和降低总三萜及五环三萜的积累，而且ZjMYB39和ZjMYB4稳定转化大叶烟草‘NC89’，得到转基因烟草中的总三萜及科罗索酸的含量显著高于WT，这些结果表明ZjMYB39和ZjMYB4是参与枣五环三萜生物合成的关键转录因子。酵母单杂交（Y1H）、GUS和双荧光素酶（LUC）活性测定表明，ZjMYB39和ZjMYB4可以通过直接结合ZjFPS和ZjSQS的启动子，激活其活性，进而提高ZjFPS和ZjSQS的表达水平，参与调控枣五环三萜的生物合成。双分子荧光互补（BiFC）试验结果显示，转录因子ZjMYB39和ZjMYB4之间不存在互作关系，它们单独作用于ZjFPS和ZjSQS基因启动子并调控枣五环三萜生物合成。 综上所述，本研究阐释了枣生长过程中五环三萜类化合物的时空代谢积累模式，鉴定了生物合成过程中的关键基因ZjFPS和ZjSQS及转录因子ZjMYB39和ZjMYB4，揭示了ZjMYB39和ZjMYB4对枣五环三萜生物合成的调控机制。研究对深化枣果实功能品质性状形成，揭示枣种质资源代谢多样性，促进以重要次生代谢物选择为目标的植物育种与改良提供科学依据，也为鼠李科其他果树提高功能品质提供借鉴。
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