摘要
癌症是严重危害全世界人民身心健康的公共卫生问题之一。研究证实，癌症晚期时治疗的治愈率要明显低于其发病初期时，因此，及早的发现和诊断是预防和控制癌症的关键。肿瘤标志物是早期癌症诊断的重要指标，因此实现肿瘤标志物的灵敏检测对于癌症早期诊断以及相关抗癌药物的开发等方面非常重要。单分子检测技术是分析化学领域中一门新兴的技术，单分子计数是单分子检测技术的一部分，通过计数单个分子可以实现超灵敏的检测，利用该技术，我们可以实现对生物分子简单、快速、低背景、高灵敏的检测。本论文通过荧光团编码生物传感器的构建结合单分子检测技术对肿瘤标志物（端粒酶和m6A甲基转移酶：甲基转移酶类3蛋白/甲基转移酶类14蛋白-METTL3/14复合物）进行检测，其具体内容如下： 1、我们利用体内修复机制和单分子检测，开发了一种基于酶促DNA修复级联驱动荧光团编码的生物传感器来灵敏的检测癌细胞中端粒酶的活性：当端粒酶存在时，（TTAGGG）n序列重复地添加到端粒酶底物（TS）引物的3′-羟基（OH）端，从而产生长的端粒产物。端粒产物随后与无嘌呤（AP）探针杂交，诱导无嘌呤/嘧啶核酸内切酶1（APE1）对双链DNA（dsDNA）中的AP位点进行切割，产生一个在5′和3′端带有生物素（Biotin）和羟基的单链DNA（ssDNA），同时释放出端粒产物，该产物又与新的AP探针杂交，产生许多ssDNA。产生的ssDNA被随后加入的用链霉亲和素包被的磁珠（MBs）捕获，然后作为引物启动无模板末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）催化的脱氧腺苷三磷酸（dATPs）和Cy5标记的脱氧腺苷三磷酸（Cy5-dATPs）随机结合到3′-OH末端，产生具有多个Cy5分子编码的长聚A链，最后形成Cy5-ssDNA-MBs复合物。磁分离后，Cy5-ssDNA-MBs被核酸外切酶I（ExoI）消化，释放出大量的Cy5分子，此时，释放的Cy5分子可通过单分子技术进行测量。该方法实现了单细胞中端粒酶的灵敏检测，以及对端粒酶的特异性检测。此外，它还可以用于抑制剂的筛选以及不同的癌细胞系与正常细胞系的区分，在临床诊断和治疗方面具有巨大的潜力。 2、我们利用RNA甲基化驱动的DNA聚合酶介导的延伸，构建了基于单量子点（QD）的荧光共振能量转移（FRET）生物传感器，可用于准确、稳定、无m6A识别蛋白和超灵敏地检测METTL3/14复合物的活性。在该传感器中，我们设计了一种嵌入5个RNA碱基（5′-rGrGrArCrA-3′）的DNA作为METTL3/14复合物的底物。当METTL3/14复合物存在时，能够催化DNA甲基化，从而防止MazF内切酶的切割。甲基化的DNA基底可以与生物素修饰的线性模板杂交，在DNA聚合酶的辅助下启动聚合延伸反应，形成具有生物素-多重Cy5的dsDNA。随后，这种具有多重Cy5的dsDNA可以自组装到605QD的表面，形成605QD-Cy5纳米结构，产生有效的605QD-Cy5FRET。这种生物传感器具有很高的灵敏度，检测限为3.1×10-17M，并且可以在单个细胞中检测METTL3/14复合物。另外，该生物传感器还可用于测量METTL3/14复合物的动力学参数和筛选METTL3/14复合物的抑制剂。更为重要的是，该生物传感器可以区分乳腺癌患者组织和正常人体组织中METTL3/14复合物的表达，为癌症发病机制研究、诊断、分类、预后和抗癌药物开发提供了有力的工具。
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