摘要
近年，基于微针的生物检测在疾病的微损伤、无痛诊断与治疗等方面表现出广阔的应用前景。目前的研究主要包括皮肤组织间液(interstitialfluid,ISF)中生物标志物的化学传感与微针界面物理化学参数测定。主要面临两大挑战：(1)检测程序复杂、耗时，通常涉及体内ISF提取、体外释放ISF等；(2)受传感技术的限制，ISF中可检测到的生物标志物种类有限。因此，发展高灵敏与可靠的新原位检测技术是拓展微针生物检测应用的关键。本论文开展了新型的表面增强拉曼散射(surface-enhancedRamanscattering,SERS)微针技术方面的研究，验证了SERS微针技术用于生物传感的可行性与通用性，并将微针技术应用于疾病的辅助诊断。主要研究内容如下： 1.核-卫星金纳米粒子沉积的内标化SERS微针的研制 发展了内标化的表面增强拉曼散射微针(IS-SERS-MN)，它主要由聚甲基丙烯酸甲酯微针、核-卫星金纳米粒子、吸附在金核上的内标(4-巯基苯甲腈)组成。核-卫星金纳米粒子通过两亲性的聚苯乙烯嵌段聚-b-乙烯基吡啶(PS-b-P4VP)对金核的静电吸附与原位金生长的方法装备在微针表面。PS-b-P4VP不仅保证了微针表面吸附金纳米粒子的密度，也能促使金纳米粒子呈单分散状态，提高了IS-SERS-MN分析的重现性。内标的引入可校正因检测条件改变等而导致的误差，从而进一步提高了IS-SERS-MN分析的准确性。所制备的IS-SERS-MN增强因子为9.49?104，为ISF中分析物的直接传感奠定了基础，可检测到0.10nM的结晶紫。活体研究结果表明，IS-SERS-MN能有效的穿透皮肤角质层到达真皮ISF、插入皮肤部位后能快速复原、插入皮肤前后吸附的金纳米粒子具有高度牢固性。所研制的IS-SERS-MN可应用于ISF相关的各种传感中，所用的SERS微针制备方法具有通用性，通过改变纳米材料的种类或形貌、聚合物微针材质等都可以开发出不同类型的SERS微针。 2.SERS微针直接传感细菌代谢物用于感染诊断的研究 临床上诊断细菌感染常采用菌落培养法，该方法检测周期长，难以满足疾病诊断的即时检测需求。前人的研究结果表明细菌代谢物可转移到生物体液中作为感染生物标志物，但利用ISF中的细菌代谢物进行感染诊断的可能性和潜力尚未得到充分探索。本研究利用所研制的IS-SERS-MN，实现了对真皮ISF中细菌代谢产物的高灵敏检测。选用绿脓菌素作为代表性的细菌代谢产物，构建体外ISF模型，研究了IS-SERS-MN对ISF中绿脓菌素的检测速度、灵敏度与标准曲线。在活体小鼠皮肤ISF中，首先考察了IS-SERS-MN对绿脓菌素检测的可行性与定量的准确性。其次考察了皮下组织中的绿脓菌素能否转移到真皮ISF中。最后建立了真实的小鼠伤口感染绿脓杆菌模型，探索了IS-SERS-MN用于细菌感染诊断的可行性。研究结果表明，IS-SERS-MN可检测ISF中低至0.30μM绿脓菌素，这较临床报道的生物样本中绿脓菌素浓度低两个数量级左右。与LC-MS结果对照，IS-SERS-MN对活体ISF中绿脓菌素具有可靠的定量能力。此外，IS-SERS-MN可明显地检测到实际伤口感染模型中细菌分泌的绿脓菌素拉曼信号，且不同时间的信号变化与伤口处细菌数变化高度相关。本研究有望应用于细菌快速、非损伤及无痛感染的诊断，促进微针技术的临床应用。 3.SERS微针间接传感H2O2用于腹膜炎发展示踪的研究 急性腹膜炎的实时动态追踪，可有效降低突发情况下所导致的血压下降和全身中毒性等急性反应。血液检测面临患者疼痛感及疾病传播风险，腹膜CT、X射线等诊断方式过程繁琐，且存在辐射损伤。本研究利用SERS探针标记的微针技术，检测腹膜皮肤ISF中H2O2来动态追踪腹膜炎的发病状态。SERS探针主要由核-卫星金纳米粒子和3-巯基苯硼酸组成。鉴于H2O2不能直接被微针上的核-卫星金纳米粒子响应，本研究利用3-巯基苯硼酸被H2O2氧化后，出现新的拉曼光谱峰来间接地检测H2O2。研究结果表明，发展的SERS探针标记的微针对H2O2传感具有高灵敏度与选择性，并能可靠地定量ISF中H2O2含量。小鼠的急性腹膜炎模型研究结果表明，ISF中H2O2拉曼信号变化与血浆中促炎症因子浓度变化趋势相符。在不同药物干预下，ISF中H2O2拉曼信号变化不同，并与腹膜的组织病理学结果相符。以上研究结果表明，发展的SERS探针标记的微针技术可以动态追踪腹膜炎的发展进程及评价不同药物的治疗效应。 4.近红外光响应的SERS揭示微针局部温度的研究 刺激响应型微针技术可实现皮肤ISF或体内组织的按需给药，在疾病的微损伤治疗领域有良好的应用前景。近红外光穿透能力强，可作为微针体内应用(如控释药物、光热治疗)的有效外界刺激因素。体内微针在吸收近红外光照射后，局部温度增加是微针在组织中进行按需给药或光热治疗的前提，但过高的温度会损害邻近组织。因此，研究微针在体内的局部温度传感方法，可评估近红外光响应型微针技术在体内的安全有效性。本研究以对近红外光照射高度灵敏的拉曼染料(3,3′-diethylthia-tricarbocyanineiodide,DTTC)作为报告分子，利用近红外光响应的SERS技术传感体内微针的局部温度。研究结果表明，柔性聚甲基链和在近红外光区强吸收是选择报告分子必不可少的两个条件。仍选用IS-SERS-MN作为研究对象，在近红外光照射下，不仅核-卫星金纳米粒子可以产生热量，促进微针局部温度的升高，而且通过Au-S键结合在核-卫星金纳米粒子上的DTTC会发生光降解，导致其SERS信号降低。微针SERS信号的变化与局部温度呈较好的线性关系。选用猪肉组织遮挡微针来模拟体内应用后，在近红外光照射下，由SERS信号改变而传感的局部温度与热成像仪结果相符，并在小鼠的肿瘤组织中验证了近红外光响应SERS技术的可行性。本研究发展的近红外光响应的SERS微针传感技术有望促进刺激响应型微针在体内的应用。
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