摘要
三七(Panax notoginseng)属于五加科人参属草本植物，是一种传统的药食同源植物。其根部可入药，含有皂苷等多种化学成分。三七具有多种药理作用，广泛应用于医药、保健品、食品和化妆品等领域。随着人们对自我健康的越来越关注，市场需求量也日益增加。然而三七人工种植方式存在适宜种植面积小、种植土壤酸化及严重金属污染等系列问题。因此，利用细胞工程技术进行不定根培养，就成为获得三七生物量和生物活性物质的重要途径。 本文以三七不定根为材料，建立250 mL摇瓶培养体系及5 L生物反应器放大培养体系，并优化培养参数及外源诱导子的添加;随后探讨了三七总皂苷的超声提取工艺;采用高效液相色谱法(HPLC),对不定根中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd和总皂苷含量进行定量分析，最后与野生及栽培三七质量进行了比较分析。研究结果如下: 1.优化并探讨培养基中激素、碳源、N/P、pH、接种量及摇床转速对不定根生长和皂苷积累的影响。在250 mL三角瓶中加入150 mL液体培养基，当大量元素中N、P元素配比为 20 mmol/L NH4NO3、9 mmol/L KNO3、1.250 mmol/L KH2PO4,添加激素 IBA 4.0 mg/L、NAA0.4 mg/L、KT 0.3 mg/L,蔗糖 35 g/L,pH 为 5.8,接种量为 6 g/L,摇床转速为110 rpm时，培养45天收获，鲜重为7.47±0.93 g,总皂苷含量为18.86±0.93 mg/g,总皂苷产量为14.47±0.68 mg。 2.将摇瓶悬浮培养后的三七不定根接入5 L生物反应器中扩大培养45天后收获，探究不同装液量、接种量和通气量对三七不定根生长和皂苷积累的影响。结果表明，当装液量为3.0 L、接种8 g、通气量达到0.10 vvm时，三七不定根的生长状态佳，鲜重为29.61±0.45g;总皂苷含量最高，达到12.44±0.65mg/g,总皂苷产量达到44.31±0.61 mg。 3.通过改变诱导子添加时间和浓度，对比不定根的生长及皂苷积累差异，考察了外源诱导子处理对不定根生长和皂苷积累的影响。结果显示，第21天加入200 μmol/L终浓度的茉莉酸甲酯对不定根皂苷积累影响最大，总皂苷的含量和产量均达到最大值，分别为136.93±1.29mg/g、87.32±0.90mg,比对照组分别提高了 8.57倍和11.09倍，且R1、Rg1、Rb1总含量为5.03 ％,符合《药典》规定值。 4.优化了三七不定根总皂苷提取工艺。结合单因素试验结果，进行响应面模型分析,得到总皂苷最佳提取条件为:料液比1∶80.74,乙醇浓度80.97 ％,提取温度70.78℃,总皂苷最大含量的理论值为11.46 mg/g。结合实际情况，确定最佳提取工艺条件为:料液比1∶81,乙醇浓度81 ％,提取温度71℃,并进行3次实际验证，测得三七总皂苷的平均含量11.41±0.09 mg/g,与预测值接近。结果表明该提取工艺条件准确可靠，具有实际应用价值。 5.建立了三七不定根连续放大培养工艺流程，并将不定根产品与市售及野生三七对比进行质量评价。不定根产品的总皂苷含量达到137.56±0.13mg/g,相当于栽培20头三七。Rg1、Rb1、R1总含量为6.72 ％,比《药典》规定值高出34 ％。单体皂苷Re、Rb1含量分别达到0.88±0.12 ％和6.54±0.08 ％,优于野生三七，高出66 ％和67 ％。 综上，本研究建立的三七不定根悬浮培养体系可以高效生产三七不定根和皂苷，并且其总皂苷含量高，优于市售20头三七，单体皂苷Rg1、Rb1、R1总含量满足国家《药典》对三七的含量要求。此培养方式突破了三七传统种植的瓶颈，显示出三七不定根培养物替代市售三七资源的潜能，为三七资源的可持续开发提供了技术依据。
NETL