摘要
研究目的： 本研究的目的为建立和评价SARS-CoV-2和HIV-1感染的血清学和分子检测方法，探究其血清学和分子特征以及与疾病预后的关联。 研究方法： 1、建立用于检测SARS-CoV-2核衣壳蛋白(Nucleoprotein,NP)特异性IgG抗体的荧光素酶免疫吸附法(Luciferase Immunosorbent Assay,LISA),并在492份SARS-CoV-2感染患者血清和88份健康献血员血清中评估该方法的诊断效能。 2、收集24名重症和76名非重症COVID-19患者的人口统计学资料以及临床治疗和转归信息，采集患者发病后不同时间点的血液、鼻咽拭子和肛拭子系列随访样本，使用RT-qPCR检测多种临床样本中的SARS-CoV-2 RNA水平以及分别使用 LISA 和酶联免疫吸附试验(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)检测患者血清中SARS-CoV-2特异性抗体。 3、建立基于成簇的规律间隔短回文重复序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats,CRISPR)和 CRISPR 相关蛋白 Cas12a 的新一代分子检测与诊断技术平台，整合逆转录-聚合酶链式反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)和 CRISPR-Cas12a 方法用于检测 SARS-CoV-2需要关注的变异株(Variants of Concern,VOCs),以提高检测方法的灵敏性和特异性。通过PCR引物在待检突变位点附近引入前间隔序列邻近基序(Protospacer Adjacent Motif,PAM),开发通用型 RT-PCR/CRISPR-Cas 12a 检测系统，确保该方法可以检测缺乏PAM序列的靶基因及其突变位点。鉴于监测SARS-CoV-2 Omicron变异株的重要性，开发特异性检测SARS-CoV-2 Omicron变异株的方法。使用SARS-CoV-2阳性的口咽拭子样本评估RT-PCR/CRISPR-Cas12a检测方法在检测和鉴别SARS-CoV-2主要VOCs的性能。 4、收集2008年1月至2012年12月广州市报告确诊的全部860例男男性行为(Men who have sex with men,MSM)HIV-1 感染者并随访至 2017 年 3 月的数据资料。分别采用Kaplan-Meier生存分析和Cox比例风险模型预测不同HIV-1基因亚型的MSM感染者从确诊感染到发生免疫抑制的时间间隔和校正风险比。 研究结果： 1、成功建立了检测抗SARS-CoV-2 NP IgG抗体的LISA血清学方法。用LISA方法检测88份健康献血员血清样本中检测到的荧光信号与空白对照无显著差异，特异度为100％。其次，检测COVID-19患者发病后第0～7天的血清样本，42.7％(35/82)的血清样本检测到抗SARS-CoV-2NPIgG抗体，血清样本中抗SARS-CoV-2 NP IgG抗体检出率在发病后的8～14天，15～21天，21～28天，以及大于 28 天分别增至 71.2％(104/146),96.7％(117/121),98.4％(61/62)和100.0％(81/81)。此外，严重急性呼吸综合征冠状病毒(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus,SARS-CoV)的 NP 特异性抗体与 SARS-CoV-2 NP 存在交叉反应性，而且这种交叉反应性存在剂量效应关系。但是未观察到中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus,MERS-CoV)的NP特异性抗体与SARS-CoV-2 NP存在交叉反应性。 2、58.0％(58/100)SARS-CoV-2感染患者在入院后收集的鼻咽拭子可检测到SARS-CoV-2 RNA,且可持续到发病后第15天。此外，分别在5.9％(1/17)和20.2％(19/94)的患者血液和肛拭子样本中可检测到SARS-CoV-2 RNA。入院后鼻咽拭子样本中SARS-CoV-2 RNA检测阳性的患者，其肛拭子样本中SARS-CoV-2RNA的检出率更高。在发病后两周内可检测到SARS-CoV-2特异性抗体，且抗体水平在发病后第17天左右达到峰值，大多数患者体内抗SARS-CoV-2抗体保持在相对较高的水平，持续长达50天。抗SARS-CoV-2抗体水平在COVID-19 患者之间存在差异，抗体滴度水平与疾病的严重程度有关，高抗体滴度组重症患者的比例显著高于低抗体滴度组（36.2％vs 7.5％,P=0.002）。 3、本研究结果表明，基于CRISPR-Cas12a系统使用特异性的crRNAs可以准确区分SARS-CoV-2刺突蛋白上的特征性替换突变（K417N/T、L452R/Q、T478K、E484K/Q、N501Y、D614G）,检测下限可达 10 拷贝/反应。以 Sanger 测序结果为金标准，本研究所分析的8个等位基因特异性crRNA的检测阳性预测值为83.3％～100％,检测阴性预测值为81.3％～100％。其次，综合分析多个特异性crRNA的检测结果可以区分SARS-CoV-2原始株和SARS-CoV-2主要VOCs。同样以Sanger测序结果作为金标准，CRISPR-Cas12a检测方法的特异度为100.0％,灵敏度为93.8％～100.0％,两种检测方法的总体一致性为98.1％（53/54）。此外，在检测感染其它常见呼吸道病原体的33份SARS-CoV-2阴性的临床样本时未观察到交叉反应。 4、基于CRISPR-Cas12a系统的检测方法可以准确鉴别5份SARS-CoV-2 Omicron变异株感染患者的临床样本，并将其与感染SARS-CoV-2原始株以及其它需要关注的变异株的临床样本区分开来（8份原始株，17份Alpha变异株、17份Beta变异株以及15份Delta变异株）。检测结果可用荧光检测仪测量或肉眼判断。此外，在检测感染9种常见呼吸道病原体的16份SARS-CoV-2阴性的临床样本时未观察到交叉反应。 5、与 CRF07_BC 和 CRF55_01B 感染者相比，CRF01_AE 和 HIV-1B 亚型感染者中免疫抑制的累计发生率和发病密度更高（P＜0.05）。与CRF07_BC感染者（7.03年）相比，感染其它主要流行的HIV-1基因亚型的患者从确诊感染到发生免疫抑制的时间间隔由长至短依次为:CRF55_01B（5.71年，P=0.014;校正HR=3.752,P=0.092）、CRF01_AE（5.18 年，P＜0.001;校正 HR=4.733,P=0.015）。HIV-1基因亚型、基线HIV-1病毒载量(校正HR=3.311,P=0.004)和基线CD4细胞计数(校正HR=0.021,P=0.046)是与疾病进展相关的显著风险因素。 6、在接受ART后的第12个月和第24个月，分别有36.0％(27/75)和52.1％(38/73)的慢性HIV-1感染者的抗HIV-1抗体水平比治疗前降低了 75％以上。患者接受ART后的HIV-1特异性抗体水平的降低与HIV-1病毒载量的下降相关，相关系数为0.556～0.848(P＜0.001)。但是，在接受治疗2年后的患者中未观察到抗HIV-1抗体转阴。从确诊HIV-1感染到启动ART的时间间隔和基线HIV-1特异性抗体水平显著影响接受ART后的抗体水平降幅。 研究结论： 1、本研究建立并评价一种用于检测抗SARS-CoV-2 NP IgG抗体的荧光素酶免疫吸附方法，该方法在鉴别SARS-CoV-2感染患者和未感染者方面展现出优异性能。该方法具有半定量等特点，且适用于不同的物种包括人类和动物血清的特异性抗体检测。 2、本研究揭示SARS-CoV-2感染者体内病毒载量和特异性抗体应答的动态变化规律，为开发SARS-CoV-2特异性血清学检测方法以及使用恢复期血浆治疗SARS-CoV-2感染患者提供了科学证据。 3、本研究建立并评价CRISPR-Cas12a介导的SARS-CoV-2变异株检测分型方法。该方法可快速检测和鉴别SARS-CoV-2变异株，具有快速开发、持续更新以及简易实施等潜力，适用于在资源有限的环境中监测SARS-CoV-2变异株。该方法可被快速更新用于检测新出现的变异株，也可以在具备SARS-CoV-2核酸检测能力的实验室中使用既有资源和已提取的SARS-CoV-2核酸实施检测。 4、本研究证实HIV-1基因亚型对男男性行为HIV-1感染者疾病进展的影响,应进一步研究HIV-1基因亚型对HIV-1的流行、患者的管理以及预防感染等方面的影响。 5、本研究表明，急性HIV-1感染者和慢性感染者在启动ART后的抗HIV-1抗体应答动力学之间存在差异，延迟启动ART的慢性HIV-1感染者的HIV-1特异性抗体水平逐渐下降但是未见抗体转阴。
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