摘要
研究目的: 单纯疱疹病毒（HSV）是一种嗜神经病毒，主要分为两个亚型:1型（HSV-1）和2型（HSV-2）。HSV-1主要在三叉神经节中建立潜伏期，可长期潜伏于机体内引起潜伏感染，当机体免疫力低下时容易复发。目前的抗病毒疗法如阿昔洛韦，伐昔洛韦等治疗药物可有效限制上皮细胞中的病毒复制以缓解临床症状，但并不能治愈感染，对消除神经元中潜伏的病毒库无效，甚至已出现HSV已对所有可用的抗病毒药物耐药。同时，由于HSV在体液和细胞介导的免疫个体中复发，因此预防性疫苗的接种可能难以发展。基于以上问题以及耐药病毒株的出现，开发一种治疗HSV的新策略是十分必要的。基因组工程HSV代表了一种有前途的抗病毒疗法，能够直接编辑或破坏病毒的遗传物质。 CRISPR（成簇的规律间隔短回文重复序列，clustered regularly interspaced short palindromic repeats）本是存在于细菌中的一种免疫保护系统，随后被开发出了一种新型的基因编辑系统，CRISPR/Cas9（CRISPR-associated protein 9）。相较ZFN系统和TALEN系统，CRISPR/Cas9的可用范围更广，基因编辑效率更高，脱靶效应更低，且其构建简单，成本低廉，更适合作为我们抗HSV-1治疗的工具。但由于Cas9蛋白本身是一个极大的分子（～160kDa）,难以通过细胞膜进入细胞。因此，我们需要利用一种有效的递送工具使得Cas9在体内发挥作用。 细胞外囊泡(Extracellular vesicles,EVs)是细胞释放到细胞内外的膜性小囊泡，在细胞间通讯中发挥重要作用，参与调节一系列生物过程。EVs广泛存在于细胞培养上清以及各种体液中，其正在成为一种新的诊断工具，一种新的治疗方法和递送工具。EVs可以装载治疗药物，RNAs,蛋白质等运送到靶细胞。同时EVs还具有穿越生物屏障，生物相容性好，可进行基因工程改造等优点。因此我们希望将CRISPR-Cas9和EVs相结合进行抗HSV-1的研究。 研究方法: 1.通过构建Cre/LoxP重组酶系统验证EVs的活性和递送效率。 2.研究Fc/Spa和PTGFRN修饰下对EVs的富集作用。 3.蛋白免疫印迹(Western blotting),电镜(TEM),纳米颗粒追踪(NTA)表征 EVs。 4.激光共聚焦(Confocal)检测EVs在细胞溶酶体的逃逸现象。 5.通过蛋白定量和RT-qPCR分别验证SpCas9和sgRNA在EVs的包装效率。6.Western blotting,RT-qPCR,空斑法和T7EI酶验证工程化EVs在体外抗HSV-1的效果。 7.RVG靶向肽在EVs中修饰及其效果验证。 8.工程化EVs的体内外毒性评价。 9.构建Ⅰ型单纯疱疹病毒感染模型,探讨工程化EVs的体内活性及抗病毒效果。 研究结果: 1.PTGFRN-Fc 能够将 Cre-Spa 富集到EVs 中。 2.Fc/Spa系统能促进Cas9/sgRNA RNP在EVs中的包装。 3.EVPTGFRN-Fc/SpCas9-Spa/sgUL29 能有效递送 Cas9/sgRNA RNP 以抗 HSV-1 感染。4.RVG修饰下的EVs具有神经靶向的作用。 5.工程化EVs不会在体内和体外产生毒性效应。 6.EVRVG-PDGFRN-Fc/SpCas9-Spa/sgUL29 能在体内发挥抗 HSV-1 的效果。 研究结论: 在本研究中，我们将人Fc结构域与PTGFRN的细胞内结构域融合并锚定在EVs膜上，而Spa蛋白的B结构域与SpCas9融合，形成Fc/Spa系统，两者间的相互作用将Cas9-RNPs富集到EVs中。同时，我们将靶向HSV-1基因组的sgRNA和Cas9结合后包装EVs中来抗HSV-1的感染。结果发现，工程化EVs能够显著提高小鼠存活率，并且能够降低小鼠组织中的病毒载量。另外在RVG修饰后EVs能够靶向三叉神经，使得Cas9/sgRNA RNPs在其中发挥显著的抗病毒疗效。本研究为基于工程化EVs的SpCas9有效递送提供了平台，为HSV感染和其他神经疾病提供了潜在的治疗价值。
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