摘要
研究背景： 最新研究显示：包括中国在内的57个国家中，癌症已经超越心血管病成为死亡率第一的疾病。根据最新预测，全球在2040年新发癌症比2020年增加47%，达到2840万例。且中国癌症的发病率和死亡率仍在增加，因此癌症仍是威胁我国人民生命安全的重要疾病。 癌症恶液质（Cancer Cachexia，CC）是癌症的主要并发症。CC以体重减轻为主，主要临床表现为厌食、骨骼肌进行性下降（伴有或不伴有脂肪组织的丢失），并进一步导致功能下降和生存期缩短。CC 涉及的机制广泛而复杂，多种因素导致肌肉蛋白水解速率超过蛋白合成速率，造成肌肉衰减（Muscle atrophy，MA），导致恶液质的发生。 骨骼肌纤维化（Skeletal muscle fibrosis，SMF）是细胞外基质（Extracellular matrix， ECM）过度堆积，致使肌肉硬化和肌肉功能下降的一种不可逆状态。在CC中，纤维化程度与生存率呈负相关。因此，抑制恶液质患者的SMF可能是延缓恶液质的有效策略。 α1 I型胶原蛋白(Collagen type I alpha 1，COL1A1)是SMF的经典标志物。COL1A1在恶液质患者肌肉组织中高表达，导致肌肉纤维化程度加剧。在主动脉纤维化、肺纤维化等疾病中，成骨转录因子2（Runt-related transcription factor 2，Runx2）可直接结合COL1A1 mRNA的启动子区域，促进COL1A1 mRNA转录，导致组织纤维化。Deltex 3L（Deltex 3 Like，DTX3L）是Notch通路主要的E3泛素连接酶。研究指出，在脑动静脉畸形组织中低水平的甲基转移酶样3（Methyltransferase-like 3，METTL3）可通过调节DTX3L的mRNA稳定性，抑制DTX3L和DTX1的异二聚化，促进Notch通路下游的基因表达。并且Notch可以经由Runx2促使SMF的发生。因此我们推测DTX3L通过Notch通路，可能具备调控Runx2的能力。 在癌症早期实施规范的营养支持被认为是缓解 CC 的有效策略之一。本课题组长期聚焦左旋肉碱（L-carnitine，LC）在癌症恶液质治疗中的作用。左旋肉碱是一种具有生物活性的低分子量类氨基酸。人体内约有95%的左旋肉碱储存在心肌和骨骼肌中，其在肌肉中的浓度为600mg/g。CC患者肌肉和血清中各种肉碱水平降低，并且CC的进展与低血清肉碱水平相关。课题组的前期研究证明左旋肉碱改善恶液质导致的骨骼肌衰减。但尚无左旋肉碱改善癌症恶液质导致骨骼肌纤维化的研究。 因此，我们将研究生理浓度下的左旋肉碱干预能否改善癌症恶液质状态下的骨骼肌纤维化及该效应是否经由DTX3L/Runx2/COL1A1通路。 研究方法： 1. 体内实验： 结肠癌MC38细胞和C57老年鼠用于建立癌症恶液质体内模型。16只C57鼠分为非荷瘤组（4只），荷瘤+非干预组（6只）和荷瘤+左旋肉碱组（6只）。植瘤6天后，使用5mg/kg左旋肉碱干预14天，每3天测量一次体重和肿瘤，并在左旋肉碱干预前和干预结束后，测量小鼠抓力，评估左旋肉碱对癌症恶液质状态下的小鼠体重、去瘤体重、腓肠肌重量和抓力的作用；干预结束后，取右侧腓肠肌进行HE染色、Masson染色和天狼星红染色；取左侧腓肠肌提取总蛋白，检测左旋肉碱对DTX3L、Runx2和COL1A1蛋白的影响。 2. 体外实验： NIH 3T3细胞贴壁后，利用10ng/ml TGF-β1处理24h，建立体外纤维化模型。在模型中检测不同剂量和不同时间左旋肉碱对 α-SMA、DTX3L、Runx2 和 COL1A1 蛋白水平以及对DTX3L、Runx2和COL1A1 mRNA水平的影响；在NIH 3T3细胞中转染Flag-Runx2验证左旋肉碱对Runx2/COL1A1通路的影响；联合CHX、MG132和免疫共沉淀，检测左旋肉碱对 Runx2 泛素化的影响；在 NIH 3T3 细胞中转染siRNA-DTX3L 验证 DTX3L 在纤维化中的作用；在 HEK 293 细胞中，共转染GFP-DTX3L和Flag-Runx2质粒，利用免疫共沉淀、免疫荧光和Duolink，检测DTX3L与 Runx2 的相互作用；在 NIH 3T3 细胞中转染 siRNA-DTX3L、GFP-DTX3L 和Flag-Runx2，检测左旋肉碱对DTX3L/Runx2通路及DTX3L与Runx2相互作用的影响。 研究结果： 1 左旋肉碱缓解癌症恶液质诱导的骨骼肌纤维化 （1）体内恶液质模型的结果显示：小鼠发生恶液质后荷瘤+非干预组肌力下降-46.59± 21.24g，荷瘤+左旋肉碱组仅下降-5.5± 15.18g，表明左旋肉碱可改善因恶液质而诱导的肌力下降（Plt;0.05）； （2）腓肠肌HE染色结果显示：非荷瘤组、荷瘤+非干预组和荷瘤+左旋肉碱组肌横截面积分别为488.61± 46.72μm2，207.46± 54.55μm2和 434.54± 113.84μm2，统计学 分析证明荷瘤+左旋肉碱组与非荷瘤组肌横截面积明显高于荷瘤+非干预组（Plt;0.05）；Masson染色结果显示：非荷瘤组、荷瘤组+非干预组和荷瘤+左旋肉碱组胶原纤维面积占比为0.039± 0.009，0.097± 0.016和0.055± 0.012，统计学分析证明荷瘤+左旋肉碱组与非荷瘤组胶原纤维面积占比明显低于荷瘤+非干预组（Plt;0.05）；天狼星红结果为：非荷瘤组、荷瘤+非干预组和荷瘤+左旋肉碱组胶原纤维面积占比为0.054± 0.023， 0.145± 0.029和0.061± 0.013，统计学显示荷瘤+左旋肉碱组与非荷瘤组胶原纤维面积占比明显低于荷瘤+非干预组（Plt;0.05）。以上结果表明左旋肉碱可以改善因恶液质造成的小鼠腓肠肌横截面积减少并降低胶原纤维面积占比； （3）左旋肉碱抑制COL1A1蛋白表达：荷瘤+左旋肉碱组和非荷瘤组小鼠腓肠肌中COL1A1蛋白表达水平明显低于荷瘤+非干预组（Plt;0.05）；体外纤维化模型中， 600mg/L左旋肉碱处理60min能抑制COL1A1蛋白表达（Plt;0.05）；处理6h，能抑制α-SMA蛋白的表达（Plt;0.05）。300-1200mg/L左旋肉碱处理60min或6h对COL1A1和α-SMA蛋白的抑制存在一定的剂量依赖；Real Time PCR结果显示，600mg/L左旋肉碱处理30min能抑制COL1A1 mRNA的表达（Plt;0.05）。 2 左旋肉碱通过Runx2调节COL1A1缓解骨骼肌纤维化 （1）左旋肉碱抑制Runx2蛋白表达：荷瘤+左旋肉碱组和非荷瘤组小鼠腓肠肌中Runx2蛋白表达水平明显低于荷瘤+非干预组（Plt;0.05）；体外纤维化模型中，600mg/L左旋肉碱处理60min能抑制Runx2蛋白表达（Plt;0.05）；剂量效应与COL1A1结果类似，左旋肉碱处理60min对Runx2蛋白的抑制存在一定的剂量依赖； （2）左旋肉碱经由Runx2调控COL1A1：体外纤维化模型中，过表达Runx2后，可以改善左旋肉碱对α-SMA蛋白、COL1A1蛋白及mRNA的抑制作用； （3）左旋肉碱促进Runx2泛素化：CHX联合左旋肉碱处理比CHX单独处理， Runx2蛋白水平下降更快，在30min表现出明显的差异（Plt;0.05）；MG132处理后，可改善左旋肉碱对Runx2的抑制作用；转染Flag-Runx2并经过左旋肉碱和MG132处理，左旋肉碱促进Runx2泛素化水平增加。 3 左旋肉碱通过DTX3L调控Runx2缓解骨骼肌纤维化 （1）左旋肉碱调控DTX3L使其恢复到正常水平：荷瘤+左旋肉碱组和非荷瘤组小鼠腓肠肌中DTX3L蛋白表达水平明显高于荷瘤+非干预组（Plt;0.05）；体外纤维化模型中，TGF-β1促进DTX3L蛋白表达，600mg/L左旋肉碱处理60min后，使DTX3L恢复到正常水平。与COL1A1和Runx2结果类似，存在一定的剂量依赖； （2）左旋肉碱经由DTX3L调控纤维化：体外纤维化模型中，抑制DTX3L后，可以改善左旋肉碱对α-SMA蛋白、COL1A1蛋白及mRNA的抑制作用； （3）在HEK 293细胞中，证实DTX3L与Runx2在细胞核和细胞质中均存在相互作用；在体外纤维化模型中，左旋肉碱可促进DTX3L与Runx2的相互作用； （4）左旋肉碱经由DTX3L调控Runx2：抑制DTX3L，可缓解左旋肉碱对Runx2的下调作用并且可使左旋肉碱对Runx2的泛素化诱导降低；与单独转染Runx2质粒相比，共转染Runx2和DTX3L质粒可恢复左旋肉碱对α-SMA蛋白、COL1A1蛋白及mRNA的抑制作用。 研究结论： 维持生理浓度的左旋肉碱可改善癌症恶液质导致的小鼠肌力和腓肠肌横截面积的减少，缓解骨骼肌纤维化；在体外模型中证实DTX3L是Runx2的E3泛素连接酶，并且左旋肉碱经由DTX3L调控Runx2泛素化，导致COL1A1降低，最终达到缓解纤维化的目的。我们的研究为左旋肉碱作为抗骨骼肌纤维化的临床药物提供了理论基础。
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