摘要
急性心肌梗死(AMI)发病速度快，死亡率高，是导致心脑血管疾病死亡率居高不下的主要原因，因此发展AMI早期诊断方法具有重要意义。研究表明，患者突发AMI时，其循环血中某些特定的microRNAs(miRNAs),例如miRNA-499,含量显著升高，故可作为该疾病的重要标志物，对其分析诊断是当前分析领域的研究热点。然而，AMI相关循环miRNA含量低，需要采用一些超灵敏的分析检测技术。球形核酸酶(SNAzymes)催化的化学发光(CL)分析体系结合了酶促反应的高效性与CL的高灵敏性等优点，可以满足miRNA检测需要。 SNAzymes是在球形核酸的基础上发展而来的纳米形式的G-四链体(G4)DNAzymes,在核酸检测中具有广阔的应用前景。SNAzymes的构建，通常以金纳米粒子(AuNPs)为核心(AuNPs-SNAzyme),巯基标记的G4通过Au-S键在AuNPs表面形成致密的DNAzyme单层，为了降低成本，本课题尝试探索一种非共价制备SNAzymes的方法。尽管目前有许多方法可以将非标记DNA修饰到AuNPs 上,但对于非标记的富G序列，在修饰过程中易形成G4二级结构，影响修饰效果。另外，非标记G4的G碱基会与AuNPs发生吸附作用，从而降低SNAzymes的催化活性。基于此，本课题开发了一种全新的双功能化非共价SiO2基SNAzymes(SiO2-SNAzyme@ABEI),旨在解决以上问题，并用于AMI相关核酸标志物的灵敏检测方面，主要研究内容包含以下两部分: 1.SiO2-SNAzyme@ABEI的构建。首先借助SiO2的多功能性，利用酰胺反应将CL试剂N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺(ABEI)共价键合到SiO2表面(SiO2@ABEI)。同时，利用五种DNA功能化AuNPs或SiO2的方法，从修饰非标记 G4 的角度对 AuNPs-SNAzyme 和 SiO2-SNAzyme@ABEI 两种 SNAzymes 进行了比较分析。结果表明，相对于AuNPs,SiO2@ABEI具有无差别吸附任意DNA序列的特性，即使是易形成二级结构的G4也容易被负载到其表面，据此制备的SNAzyems表现出良好的催化活性。另外，整个修饰过程对修饰方法没有严格地要求，几乎所有DNA功能化AuNPs的方法均适用于SiO2-SNAzyme@ABEI的制备。据此发展了一种整合CL试剂与催化剂的SiO2-SNAzyme@ABEI制备方法,相对于未功能化的SiO2,该SiO2-SNAzyme@ABEI的CL强度提升了约1200倍，呈现出优异的CL分析性能，为其在生物标志物分析检测方面的进一步应用奠定了良好基础。 2.AMI相关核酸标志物的超灵敏CL检测。在以上工作基础上，我们进一步构建了一种能够探测目标核酸的双功能化CL纳米探针，用于AMI相关核酸标志物的高灵敏分析检测。以目标核酸分子来触发DNA三臂结构的形成，构建了一种超灵敏检测AMI标志物的CL检测平台，检测限为0.8 fM(S/N=3),且线性范围宽（10fM-100pM),在1 ％的血清中具有优异的抗干扰能力。与传统的AuNPs-SNAzymes相比，我们发展的非共价双功能CL纳米探针在保留超高分析性能的前提下，简化了制备过程，从而降低成本，有力拓展了其在AMI相关核酸标志物分析诊断方面的应用前景。
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