摘要
枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)具有较完整的糖苷水解酶分泌系统，是纤维素酶和半纤维素酶潜在的生产菌株。纤维素酶生产受外部环境因素和基因表达水平的影响。本课题利用从自然界中分离纯化得到的枯草芽孢杆菌Z2(BacillussubtilisZ2)作为出发菌株，研究了氧化石墨烯(grapheneoxide，GO)胁迫条件对其纤维素酶生物合成的影响，并通过转录组学解析了木质纤维素酶、胞外酶和酶合成相关信号通路中的差异表达基因。在此基础上，利用模块化合成生物学策略在B.subtilisZ2中构建了NAD+生物合成及NADH的再生模块，显著提高了其纤维素酶的产量，并揭示了胞内纤维素酶合成的调控机制。本论文主要开展了如下研究工作： 首先研究了不同碳源和氮源对B.subtilisZ2纤维素酶活性的影响特性。结果表明，以预处理后的稻草秸秆为碳源，酵母浸粉为氮源获得最高的FPase(总纤维素酶)、CMCase(内切葡聚糖酶)和β-葡萄糖苷酶活性，分别为0.57±0.04、5.54±0.11和1.80±0.08U/mL。在此基础上，通过响应面法对产酶条件进行优化，结果显示，碳源添加量为6%(w/v)，氮源添加量为0.6%(w/v)，pH7.0和温度为40℃条件下得到最大的纤维素酶活性为5.64±0.15U/mL。此外，利用B.subtilisZ2粗酶液和商业木聚糖酶协同水解碱预处理后的稻草秸秆，发现在第48h得到最大的还原糖浓度为84.27±5.13mg/mL。为了验证B.subtilisZ2所产的内切葡聚糖酶的持续水解能力，通过原核表达系统表达并纯化得到了内切葡聚糖酶EG5Z(包含催化结构域和碳水化合物结合模块CBM3)和EG5Z-1(仅包含EG5Z的催化结构域)，并分析了它们的酶学特性。结果表明，EG5Z和EG5Z-1都具有可持续性水解能力，EG5Z的热稳定性更好，与不溶性底物结合的能力更强，且与木聚糖酶协同酶解木质纤维素可得到更高的还原糖浓度。 论文重点研究了GO胁迫对B.subtilisZ2木质纤维素酶基因表达调控的影响。在添加10μg/mLGO条件下，得到最高的FPase活性(0.71±0.01U/mL)、CMCase活性(6.74±0.14U/mL)和β-葡糖苷酶活性(1.89±0.12U/mL)，与对照组(0.52±0.02U/mL、4.12±0.19U/mL和1.52±0.08U/mL)相比分别提高了0.36、0.64和0.24倍。为了揭示GO胁迫条件下B.subtilisZ2高产纤维素酶的调控机制，论文进行了在GO胁迫条件下菌株的转录组测序分析。与对照组(不添加GO)相比，4个与胞内钙离子稳态和钙信号转导相关基因(calJ,chaA,tcaB和spcF)在实验组(10μg/mLGO胁迫)中上调表达；在培养基中添加钙离子抑制剂(LaCl3或EGTA)或敲除spcF基因导致B.subtilisZ2纤维素酶活性下降，进一步证明了GO胁迫条件下纤维素酶基因的过表达是通过钙信号调控的。 转录组数据分析结果表明：与对照组相比，实验组中NAD(H/+)合成及电子传递链相关基因的转录水平也上调表达。因此，利用模块化合成生物学策略构建了NAD+生物合成模块(模块1-3)及NADH的再生模块(模块4),并分析了胞内NAD(H/+)水平对B.subtilisZ2纤维素酶合成的影响。结果表明，来自四个模块中的5个基因(ycel,nadV,nadM,mdh和sucB)对胞内NAD(H/+)水平和纤维素酶产量影响显著。逐个组装这5个基因发现，共表达基因ycel,nadV,nadM和mdh的工程菌株(BA-4)胞内NADH水平是野生型菌株(wild-type,WT)的13.09倍，且纤维素酶活性最高为10.95±1.78U/mL，比WT(5.37±0.37U/mL)提高了1.04倍。通过阻断WT、BA-3(共表达基因ycel,nadV和nadM)和BA-4的钙离子通道或敲除spcF基因，导致菌株的纤维素酶活性均下降，充分证实了B.subtilisZ2胞内NADH通过钙信号调控了纤维素酶基因的表达。
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